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临床期非小细胞肺癌患者隐匿性微转移的检
LindaW.Martin,JonathanD’Cunha,XiaofeiWang,DebraHerzan,LinGu,NaifAbraham,ToddL.Demmy,FrankC.Detterbeck,ShawnS.Groth,DavidH.Harpole,MarkJ.Krasna,KempKernstine,LeslieJ.Kohman,G.AlexanderPatterson,DavidJ.Sugarbaker,RobinT.Vollmer,MichaelA.Maddaus,andRobertA.Kratzke
摘要
目的:未检测的隐匿微转移灶(OM)的存在可能是临床分期I期非小细胞肺癌(NSCLC)患者术后转归不一的潜在因素,癌症和型白血病联盟B项目是一项旨在评价OM预后意义的前瞻性研究?
材料和方法:年至年间,11家机构共纳入例疑似临床Ⅰ期(T1-2N0M0)非小细胞肺癌患者?收集患者的原发肿瘤和淋巴结(LNs)并送至指定检测中心进行分子分析?原发肿瘤和淋巴结均通过免疫组化(IHC)方法测细胞角蛋白(AE1/AE3)及RT-PCR检测癌胚抗原来鉴定OM?
结果:患者中有例接受了完全手术分期?例(61%)病理I期NSCLC患者(T1,58%;T2,42%)被纳入最终分析,其中,56%为腺癌,34%为鳞癌,10%为其他组织类型?经免疫组化分析的例患者的淋巴结中;有41例(14%)为IHC阳性(42%在N1组,58%在N2组)?尽管总生存期(OS)与无病生存期(DFS)与IHC阳性率无关,但是,N2淋巴结IHC阳性的患者生存率明显更差,差异具有统计学意义(危险比为2.04,P=0.)?经RT-PCR分析的例患者的淋巴结中,有例(69%)为PCR阳性(52%在N1组,48%在N2组)?总生存期及无疾病生存期与PCR阳性率无关?
结论:在组织学阴性的非小细胞肺癌患者淋巴结中,通过免疫组化检测AE1/AE3和RT-PCR检测癌胚抗原的方法能够检测到相应的肺癌标志物?在这项前瞻性多中心临床试验中,通过免疫组化方法确定N2组淋巴结存在OM的非小细胞肺癌患者生存缩短?其临床意义需要进一步研究?
引言
与其他恶性肿瘤不同,根治性手术切除的早期非小细胞肺癌(NSCLC)患者预后不好预测?Ⅰ期非小细胞肺癌的5年生存率为40%~90%1-3?15%~20%I期患者术后5年内出现局部和远处复发4,5?术后转归差别较大的一种解释是肿瘤区域淋巴结的隐匿性微转移灶(OM)的存在?目前外科病理技术可能误将II期或III患者归为I期,对淋巴结更加细化的评估理论上可以更好地对手术患者进行分期?更为准确的分期也能更好的判断预后,并分辨出可能复发的患者,对这些高危患者进行辅助性干预来降低其复发的可能性?
对于肺切除术中切除的肺门,纵膈,肺叶淋巴结的标准流程是将结节按3~4毫米厚度进行连续切片?用石蜡包埋组织,切片,并用苏木素和伊红染色(HE),光镜显微镜查找恶性细胞?这种技术操作下,可能由于样本问题或正常细胞的掩盖等原因,仍有可能漏掉微小转移灶,这些显微镜下的OM是否与具有临床相关性仍有争议?
80年代以来,研究人员通过细胞角蛋白染色来加强上皮细胞的检测来检测OM?在乳腺癌,免疫组化检测区域区域淋巴结受累情况可以准确的预测复发6?在非小细胞肺癌中,美国大学的外科医生肿瘤学组Z试验通过免疫组化法检测骨髓,胸腔灌洗液,和淋巴结中CAM5.2和AE1的表达,发现淋巴结不存在OM和存在OM的两组患者之间DFS和OS有显著差异7?
针对肿瘤特异性mRNA的RT-PCR检测具有高度敏感性,能够检测出组织学阴性淋巴结内的少量肿瘤细胞?与定性RTPCR只能给出是或否不同,定量RT-PCR可以估算组织中的肿瘤负荷?癌胚抗原是一种参与细胞间黏附的糖蛋白,它在乳腺癌和胃肠恶性肿瘤中表达8,9,也可以在NSCLC患者的外周血中检测到10,11?在GALGB试验中,应用定量RT-PCR技术检测淋巴结和骨髓中癌胚抗原的表达并进行探索性分析,以确定其在识别和量化NSCLC患者转移中的作用?
在此,我们将CALGB的结果作为前期报告的后续12,13?(CALGB现在是肿瘤临床试验联盟的一部分)?这项研究的目的是检验具有OM的I期非小细胞肺癌患者复发提前和术后生存缩短的假说,如果这个假设被证实,它可能会改变肺癌患者淋巴结的病理评估标准,并会影响早期非小细胞肺癌的治疗方法?
材料和方法
研究目标
CALGB的主要研究目标是明确组织学阴性的LNs或BM经IHC或RT-PCR方法检测到OM的I期NSCLC患者是否预后较差?次要研究目标如下:评估LNs或BM中OM的发生率;评估IHC与RT-PCR的敏感性;采用IHC或RT-PCR方法分析肿瘤大小?分期和OM的关系;评估OM和DFS的关系;研究发生OM的部位是如何影响复发率?复发部位以及生存?
研究设计
研究模式图见图1?入组标准为根据美国癌症联合协会(AJCC)分期手册第6版本的标准确诊或怀疑为NSCLC临床I期患者,T1(0~3cm)或T2(3cm,支气管内或有脏层胸膜受侵)?所有患者在入组前均通过病史?体格检查?PS评分?胸部X线片?胸部CT进行评估?要求患者为N0,如胸部CT扫描示淋巴结1cm或纵膈镜检查阴性?该研究未使用PET-CT?要求患者可以进行开胸或经胸腔镜的肺叶切除术或全肺切除术,年龄18岁,没有肺癌或其他恶性肿瘤病史,除外非黑色素皮肤癌?宫颈原位腺癌或无瘤生存5年的非肺癌肿瘤?所有患者均未进行新辅助治疗?该方案经机构评论董事会全票通过,所有患者已签署知情同意书?所有患者进行了手术切除,几乎每个患者进行了肺叶切除术,并进行了纵膈淋巴结切除术(所获组织的详细信息在组织收集和处理部分进行了总结)?随访时间共5年,每6个月随访一次,直到肿瘤复发或患者死亡,随访内容包括病史和体格检查;随访时不进行常规影像学检查,而是依靠外科医生的判断力?
组织收集和处理
依据手术量和CALGB成员情况,有11个研究中心参加了该项研究?在手术开始前抽取骨髓,使用灭菌注射器从髂嵴收集5~10ml骨髓,一半保存于EDTA管,另一半速冻起来?所有的样本都送到同一个中心实验室(R.A.K和M.A.M)?在肺切除前,分别对右肺的4,7,9,10,11组,和左肺的5,6,7,9,10,和11组进行淋巴结取样?淋巴结处理流程如图1?淋巴结分为两部分,一半被送去做常规组织学检查,另外一半回收?冷冻保存于液氮中,并送到一个中心实验室进行分析(在明尼苏达大学R.A.K实验室做PCR分析;在明尼苏达大学改进修正认证实验室做IHC)?为了防止淋巴结被原发肿瘤细胞污染,在肺松解或切除前获取淋巴结,单独分装每个淋巴结,防止其交叉污染?在机构的病理学家对肺切除的标本进行处理以后,又额外收集了第11站的淋巴结,并从原始肿瘤中取1.0cm3的标本?将这两种标本进行冷冻处理?然后保存被证实患有良性疾病的患者身上获取的组织标本,作为IHC和RT-TCR的阴性对照组?
RT-PCR和免疫组化技术
免疫组化应用多克隆细胞角蛋白抗体cocktail检测所有淋巴结14?原发肿瘤组织用来进一步明确诊断和测定AE1/AE3的表达(%表达则为阳性)?以统一的方式处理每一个淋巴结标本,以确保HE染色与免疫组化染色相匹配?需要特别注意的是,每一个组织块取3片:第一片用于常规HE染色;第二片用于细胞角蛋白免疫组化染色;第三片作为免疫组化的对照?对于免疫组化,我们用Dako预先稀释的AE1/AE3产品N(Dako,Carpinteria,CA),用蛋白酶~进行20分钟的预处理(Ventana医疗系统,Tucson,AZ)后,用3,3＇-二胺基联苯胺检测试剂盒~(Ventana医疗系统)继续处理?切片由两名病理学家(R.T.V.和N.A.)根据以前的方法独立判定14?
按前述RT-PCR法检测CEAmRNA的表达13,15?阳性或阴性的分界点是根据PCR循环阈值数来确定的,阈值=45为阳性,阈值45为阴性?从每个样本中随机抽取10%重复RT-PCR分析?结果显示接近百分之九十原发性肿瘤也可以检测到CEA的表达?
数据的质量控制和统计分析
我们估计将近一半患者的淋巴结中会表达IHC或者PT-PCR标记物?本项研究假设IHC阳性和阴性患者所占百分比相同,在双侧显著性水平为0.01的情况下进行对数秩检验,有80%的检验效能发现没有IHC标记物患者的三年生存率为70%,有IHC标记物患者下降至50%(风险比HR1.94)一型计算错误用邦费罗尼矫正,计划需要有名患者,其中排除了40%到50%的患有良性疾病,小细胞癌和晚期疾病患者?最终样本数为例?
基于细胞角蛋白染色和PT-PCR的OM结果通过Fisher精确检验作对比16?用逻辑回归分析评估自变量肿瘤的大小(直径)和因变量淋巴结中OM的出现率17?样条函数被用于探索在肿瘤大小和OM的出现率之间的非直线关系(数据并没显示)18?Kaplan-Meier曲线显示了OS(从手术切除术到死亡)和DFS(从手术到各种原因出现的复发或死亡,出现不分先后)19?
采用Cox比例风险模型20检测OM和OS的关系,对年龄(连续变量)?PS(PS=0vsPS=1,2)?性别(男v女)?种族(白种人v非白种人)?体重下降(过去6个月体重下降=5%或没下降v体重下降=5%)?组织类型(腺癌v鳞状细胞癌)?肿瘤大小?过去接受化疗或放疗(是v不是)进行了调整?最终模型中的解释变量使用逐步算法,初始显著性水平0.2和最终显著性水平0.05进行选择?OM变量纳入该模型中?最终模型每个变量的危险比例假说采用log-log和Schoenfeld残差图进行检测21?对风险比例假说进行了特定变量评分和总评分?没有明显证据表明这种假设违反了均衡原则?所有的报道的P值都是双边性?
联盟统计和数据中心进行了数据收集和统计分析?数据质量由同一小组的研究领头人遵循联盟统计和数据中心的政策所进行的数据回顾所保证?分析是基于从年9月16号停止的实验数据所进行的?
结果
这项研究开始于年4月,到年1月收集名患者后停止入组,并最终于年六月终止?这些患者中,例处于NSCLC的IA或IB期;排除标准见图2?例患者按照标准肺叶切除术进行了R0切除术;21例通过胸腔镜做了肺叶切除术,20例手术报告未能获得?
遵守所有淋巴结站的是39%(中有例)?81%的病例至少三站淋巴结取样并进行主要检验(中有例;附录表A1,仅在线)?所有病例的中位随访时间为8.4年(0.97至11.4年),7例除外:1名失访和6名患者退出研究?随访终止时,例死亡?局部复发的仅24例,局部和远处复发的有18例,只有远处复发的27例?57例(19%)接受辅助治疗?骨髓标本仅在少数患者可获得?样品质量差别很大;许多样品细胞成分少,因此,骨髓数据没有在最后的分析中进行评估?
免疫组化分析
对例中的例IA或IB期非小细胞肺癌患者进行免疫组化分析?41例(13.8%)免疫组化结果显示阳性?1例HE染色阴性但免疫组化阳性的患者,淋巴结如图3A-3C所示?表1包含基于IHC状态的临床和人口统计学数据?在IHC阳性或IHC阴性患者间基线特征差异无统计学意义?OS和DFS的Kaplan-Meier曲线IHC状态如图4a和4b所示,无明显差异?表2通过Cox比例风险模型给出了IHC阳性伴N1或N2淋巴结转移与IHC阴性的相对影响的HR评估?已知的预后因素:年龄的增加,男性,和PS1或2与缩短的OS和DFS显著相关?变量调整后,OS与IHC状态相关具有统计学意义(P=0.01)?具体来说,患者免疫组化N2淋巴结阳性的患者相对于IHC阴性的生存率更差(HR2.04,95%CI1.14,3.66)?患者免疫组化N2淋巴结阳性的患者五年生存率为50%(95%可信区间:29.1%至67.8%),IHC阴性患者为66.9%(95%可信区间:60.9%,72.2%),P=0.17?免疫组化N1淋巴结阳性的患者与IHC阴性的患者相比,生存率差异无统计学意义?
PCR数据分析
RT-PCR的数据分别为例IA和IB期疾病(表3)?总体而言,通过RT-PCR测定,68.8%的患者有OM?附录表A2(在线)通过Cox比例风险模型给出了PCR阳性的N1或N2淋巴结与PCR阴性间相关性的分析?PCR状态与OS和DFS之间没有显著的相关性(附件图A1a和A1b?在线)?
分期系统的影响
我们使用AJCC第七版肺癌分期系统对T分期和OM的关系进行二次分析?只有超过10%的患者基于肿瘤大小被归为II期?所有终点都使用AJCC第七版分期模式对T分期进行校正后再分析?考虑T分期的变化的影响后,没有改变对IHC或RT-PCR所鉴定的OM对OS或DFS影响的结果?
讨论
传统组织病理学定义的I期病人,通过应用抗角蛋白抗体cocktail进行免疫组化证实13.8%有N1或N2淋巴结转移,通过RT-PCR检测CEA有接近69%的患者有N1或N2淋巴结转移?58%患者N2组淋巴结免疫组化检测阳性,48%患者PCR检测N2组淋巴结阳性?尽管这种微转移病灶发生率很高,然而只有通过免疫组化检测出的N2隐匿性转移能够显著影响患者的生存(HR,2.04),其五年生存率下降约17%?CALGB的次要目的是确定两种技术鉴别隐匿微转移的敏感性?显然RT-PCR有更高的敏感性,然而,可能由于CEA对NSCLC并不特异,因而其临床影响并不重要?无论应用免疫组化还是RT-PCR我们都不能发现肿瘤大小或是T分期与隐匿微转移发生频率之间的相关性,即使应用AJCC7版分期标准对现有数据进行再分析?无论免疫组化还是RT-PCR检测到的隐匿微转移对DFS都没有显著影响?
我们知道I期NSCLC的患者有很高的复发率,并且与其他I期恶性肿瘤相比5年生存率很低?许多I期NSCLC异质性的理论已被提出:部分肺癌表达的抑癌基因会在肿瘤切除后消失吗?这归因于不同的肿瘤生物学特性(如增殖率,细胞间基质侵袭酶的表达,肿瘤微环境,新生血管形成,启动子甲基化,或逃避免疫破坏)22,23?现在可以用RT-PCR对循环肿瘤细胞进行检测,但是否存在临床相关性仍有待观察?
病理学特征也可作为预后预测因子,如脏层胸膜浸润,分化程度及淋巴管侵犯5,24?也许更好的大体病理处理有助于更精确的分期诊断?Ramirezetal25发现90%的肺切除标本在病理学家完成鉴别后仍有一些不能明确的淋巴结?这些N1淋巴结组织学阳性的比例高达11%?对于传统组织病理学分期为I期的患者而言,隐匿微转移的出现为患者表现出较差的预后提供了一个合理的解释?然而,现有严格设计及执行的前瞻性研究仅在免疫组化而非RT-PCR证实的N2淋巴结阳性病例显示出明显的生存差异?
另外一项重要的临床研究致力于研究I到III期NSCLC7的隐匿微转移?更大的样本量(例HE染色为N0的患者)可能会检测到我们的研究没有出现的相对较小的差异;或者细胞角蛋白标志物的选择导致了两个研究的敏感性的差异?最可能的原因是用多种因素解释早期肺癌的异质性?最终,通过对多个临床病理预后指标综合分析,创建一个评分系统用以确定有高复发风险需要接受一些辅助治疗的患者?
这项实验存在一些潜在的局限性?实验的样本量可能没有大到足以检测出显著的生存差异,因而可能使隐匿微转移对生存和复发的影响被过高估计?这项研究的进行在常规使用PET/CT扫描之前,PET/CT能够为发现期别更高的肿瘤提供可能?RT-PCR在原发性肿瘤中阳性率仅为90%;因而有10%的患者用这项技术检测淋巴结结果为阴性?CEA可能不是预测隐匿微转移发生及恶性程度的最佳指标?骨髓标本的收集?细胞构成及质量等诸多问题使得研究者无法回答骨髓微转移是否影响结果?对免疫组化数据和RT-PCR数据进行比较,我们发现二者一致性较差?这意味着CEA表达的表观遗传调控在NSCLC隐匿微转移中的作用值得进一步研究,但不能在当前样本中实现?这种情况也可能是因为在隐匿微转移的淋巴结中使用了不同标志物进行评价?此外,RT-PCR和结果缺乏相关性进一步验证了RT-PCR在NSCLC临床实践应用中缺乏实用性?最终,部分病人接受了辅助治疗,可能会降低隐匿微转移对预后的影响?免疫组化N1淋巴结阳性以及PCR阳性的N1/N2淋巴结缺乏阳性结果,驳斥了以往在早期NSCLC大量回顾性研究中得到的结论?然而,这项试验的优势在于从外科和组织处理的角度使用严格的标准化方法得到Ⅰ期非小细胞肺癌隐匿微转移临床意义的数据?
总之,通过对标准病理技术分期为I期或N0的NSCLC患者进行免疫组化染色,当N2淋巴结存在隐匿微转移时患者总生存期缩短?我们不能证明免疫组化判定N1淋巴结为阳性或RT-PCR检测出N1或N2淋巴结阳性的患的患者OS或DFS存在差异?我们的结果表明可考虑对组织学阴性的淋巴结进行细胞角蛋白标志物的常规染色来判断是否存在隐性微转移?基于这些研究结果的基础上决定治疗策略仍然是一个复杂的问题?我们的数据表明需要对其它因素进行进一步研究,如肿瘤生物学,充分了解早期NSCLC的生物学行为?
JClinOncol34:-.?byAmericanSocietyofClinicalOncology
(本刊负责人:徐震纲;审校:张彬;翻译:张敬东,中国医院)
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