金花茶体外抑制人体分化鼻咽癌细胞生长及V

金花茶体外抑制人体分化鼻咽癌细胞生长及VEGF-C\VEGFR-3的表达

沈洁

：目的:金花茶(Camelliachrysantha(Hu)Tuyama,CCT)是一种具有极高药用价值的天然中草药。金花茶属无毒级天然药物,金花茶叶含有多种氨基酸、茶多酚、黄酮类等多种人体所需的有益成分,而且还富含对人体有重要的保健作用的微量元素。金花茶在降低血脂、血糖,防癌、抗癌等方面具有特殊功效。其抑制肿瘤的作用及机制已有初步探讨,研究发现金花茶在大鼠体内外均用明显的抑瘤作用。但是对鼻咽癌细胞抑制作用的研究国内外未见相关报道。本实验通过观察金花茶醇提物体外对人低分化鼻咽癌株CNE-2细胞增殖、细胞周期和细胞凋亡的影响以及淋巴管生成因子及受体VEGF-C\VEGFR-3蛋白表达的影响,为进一步研究发现金花茶抑制肿瘤细胞生长的机制奠定理论基础。

方法：

1.采用MTT法检测不同浓度(25μg/ml、50μg/ml、μg/ml、μg/ml、μg/ml)的金花茶醇提物在不同时间(24h、48h、72h)作用下对CNE-2细胞的体外增殖抑制效应。

2.在倒置相差显微镜下观察不同浓度(50μg/ml、μg/ml、μg/ml)的金花茶醇提物作用CNE-2细胞后的细胞形态变化。

3.利用hoechst染色在荧光显微镜下观察不同浓度(50μg/ml、μg/ml、μg/ml)的金花茶醇提物作用CNE-2细胞后的凋亡细胞形态。

4.流式细胞术分析不同浓度(50μg/ml、μg/ml、μg/ml)的金花茶醇提物作用CNE-2细胞后的细胞周期变化及凋亡率。

5.应用蛋白免疫印记技术(WesternBlot)方法检测不同浓度(50μg/ml、μg/ml、μg/ml)的金花茶醇提物作用CNE-2细胞后细胞内Caspase-3蛋白表达的影响。

6.酶联免疫吸附法(ELISA)检测不同浓度(50μg/ml、μg/ml、μg/ml)金花茶醇提物作用CNE-2细胞后的细胞上清液中淋巴管内皮因子及受体(VEGF-C\VEGFR-3)蛋白的表达变化。

结果：

1.金花茶醇提物对CNE-2细胞具有生长增殖抑制作用,抑制效果有时间和剂量依赖性,随着时间的延长和浓度的增加,抑制效果逐渐增强。浓度大于50μg/ml的金花茶醇提物与阴性对照组相比,差异均有极显著性意义(p0.01)。

2.在倒置相差显微镜下观察随着药物浓度的升高,金花茶醇提物作用CNE-2细胞48h后,由生长停滞,逐渐使细胞皱缩变小、变圆,脱落,最后可见大量细胞收缩、破碎,脱落细胞悬浮于培养液中。

3.在荧光显微镜下,不同浓度的金花茶醇提物作用CNE-2细胞48h后可观察到呈现致密浓染的强蓝色荧光,核固缩、核裂解,核染色质聚集的凋亡细胞形态,随着浓度的增高,凋亡细胞逐渐增多。

4.金花茶醇提物作用CNE-2细胞48h后,随着浓度升高,G1期的细胞数比例增加,而G2、S期细胞比例均有不同程度的减少,细胞被阻滞于G1期。同时随着浓度升高,凋亡率也随之增高,与阴性对照组比较差异均有显著性意义(p0.05)。

5.WesternBlot实验:随着药物浓度的增加,活化的Caspase-3蛋白条带逐渐加深,表达增强。用凝胶图像处理系统分析测定积分光密度值,与GAPDH条带和阴性对照组的积分光密度值比较差异均有统计学意义(p0.05)。

6.ELISA实验:随着药物浓度的增加,CNE-2细胞培育上清液中的VEGF-C\VEGFR-3蛋白表达水平下调。

结论：

1.金花茶醇提物在体外能够抑制CNE-2细胞的增殖,且存在时效关系和量效关系。

2.其抑制鼻咽癌细胞生长的作用机制可能是通过诱导G1期阻滞和Caspase-3蛋白表达的上调从而促进细胞的凋亡。

3.ELISA试验表明了VEGF-C\VEGFR-3蛋白的表达有可能在人鼻咽癌转移的防治中发挥一定的作用。

：金花茶醇提物人低分化鼻咽癌细胞细胞周期凋亡率Caspase-3VEGF-C\VEGFR-3

：桂林医学院

：硕士

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