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诸如生物发光成像，化学发光成像和余辉成像之类的光学成像策略已引起人们极大的兴趣。迄今为止，生物发光成像已被广泛地用于跟踪细胞、监测基因表达、感测小的生物活性分子和肿瘤成像。但是，传统生物发光成像的可见光波长短（可见光，-nm），这给体内成像带来了强大的组织吸收和散射的固有局限性，限制了以高灵敏度和高时空分辨率对来自深部组织的信号的检测。通过生物发光共振能量转移（BRET），改善了肿瘤和淋巴结成像以及酶活性的分子成像，但散射效应仍然是一个障碍物，在组织的较大的穿透深度会模糊图像。

生物发光成像已广泛用于生命科学和生物医学应用中。然而，常规的生物发光成像通常在可见光区域工作，由于强烈的组织吸收和散射，限制了高性能的体内光学成像。为了解决这一问题，复旦大学化学系张凡课题组开发了一种生物发光探针（BPs），其与一种特殊设计的花青染料FD-结合使用，利用生物发光共振能量转移(BRET)和两步荧光共振能量转移(FRET)，在nm处的第二近红外(NIR-II)区域发射光进行体内成像。具有生物相容性的NIR-II-BPs已成功应用于小鼠的血管和淋巴管成像，其信噪比比是正常小鼠的5倍，空间分辨率是正常小鼠的1.5倍。能量转移策略的灵活性还可以调节生物发光探针的发射波长，从而可以在活体小鼠中同时对浅表血管和肿瘤组织进行高性能的多色成像。此外，由于NIR-II-BPs42依赖于三磷酸腺苷（ATP），在实体瘤和转移性肿瘤中进行细胞内ATP介导的成像时，NIR-II-BP能够以83.4的高肿瘤与正常组织比率识别肿瘤转移，这表明NIR-II-BPs在转移灶追踪中可能具有很大的前景。

图1.合成NIR-II-BP的示意图和NIR-II生物发光的机理。

图2.NIR-II-BP的合成和表征。a）FD-的合成路线。b）FD-在浓度为1、2、5、10为0的DSPE-PEG胶束中的吸收光谱（从底部到顶部）。虚线表示胶束中的12中的吸收光谱（从底。c）浓度为1、2、5、10的DSPE-PEG胶束中FD-的荧光发射光谱（从下到上）。插图：在nm激发下，DSPE-PEG胶束（10（E）中FD-的NIR-II荧光图像。d）Cy5、Cy7.5、FD-的UV/VIS/NIR吸收和发射光谱以及萤光素酶的生物发光。虚线和实线分别是指吸收光谱和发射光谱。e）PBS缓冲液中NIR-II-BPs的代表性TEM图像和大小分布。f）PBS缓冲液中NIR-II-BP的生物发光发射光谱和吸收光谱。g）NIR-II-BP在小鼠血清中的光稳定性。h）在不同的检测窗口中，在不同深度浸没有1％脂质的NIR-II-BP填充的毛细管的生物发光图像。i）以g为单位的高斯拟合强度数据的FWHM与不同脂质内深度的关系。

图3.NIR-II生物发光和荧光成像之间的信噪比和光热效应的差异。a）光学成像示意图。b）在5毫米鸡胸组织下的NIR-II荧光图像（上）和NIR-II生物发光图像（下）。c）用于NIR-II荧光成像和NIR-II生物发光成像，填充具有不同厚度的鸡胸组织的NIR-II-BP的毛细管的信噪比。d）对鸡胸组织进行热效应研究的示意图。e）在nm（mWcm-2），nm（mWcm-2）和nm（mWcm-2）下对鸡胸组织连续照射30对鸡胸组后进行光热成像。f）不同激发波长照射下记录的鸡胸组织温度变化曲线。g）裸鼠在发波nm(射下记-2)、射下记录的鸡胸-2)和29射下记录的鸡胸组织温-2)下照射30射后的皮肤温度。h）不同激发波长照射下记录的裸鼠皮肤温度变化曲线。

图4.外部激发光对NIR-II生物发光和荧光成像信号均匀性的影响。a）不均匀照明的照片（顶部）和示意图（底部）。b）在不均匀照明（上图）和NIR-II生物发光成像（下图）的NIR-II荧光成像中，充满NIR-II-bps的毛细管的光学图像。c）在NIR-II荧光成像和NIR-II生物发光成像中，沿毛细管的强度分布（g）。d）典型的高斯点扩散函数光斑。e）d中高斯点扩散函数中沿虚线的具有相同颜色的强度分布。f）关于不均匀照明的体内研究插图。静脉注射NIR-II-BP后，小鼠淋巴管上的NIR-II生物发光（g）和NIR-II荧光（h）成像。i）沿g，h的红色虚线的强度曲线以及考虑到激发光强度分布的校正强度分布。

图5.比较NIR-II生物发光和荧光信号之间的血管和淋巴管成像。静脉注射NIR-II-BP后，小鼠腹部血管（a），淋巴管（b）和脑血管（c）的a–cNIR-II生物发光成像（左）和NIR-II荧光成像（右）。注射后约5分钟，在NIR-II荧光成像中清楚地检测到来自腹腔血管和肝脏的强烈荧光信号以及组织自身荧光背景。但是，在NIR-II生物发光成像中，这些自体荧光背景噪声被大大降低，导致腹部血管更清晰，半峰全宽（FWHM）小于其的1.3倍（成像深度?1mm）。同时，通过NIR-II生物发光成像（20.7），血管的SNR也比NIR-II荧光成像（3.9）提高了近5倍。在更清晰的淋巴管成像（FWHM降低了1.5倍）和高SNR（提高了5倍）和脑血管成像（FWHM降低了33％，SNR升高了3.5倍）中也获得了类似的结果。

图6.使用NIR-II-BP的体内多重成像。a）描述CT-26肿瘤小鼠用于双通道生物发光成像的照片。b）使用NIR-I-BP和NIR-II-BP对肿瘤组织（左上）和血管（左下）进行双通道生物发光成像。放大的高倍率双通道图像（右下方）显示CT-26肿瘤与血管之间的精细结构。c）淋巴系统双通道生物发光成像的示意图。d）使用NIR-I-BP和NIR-II-BP对淋巴系统进行双通道生物发光成像。红色通道1：NIR-I-BP，蓝色通道2：NIR-II-BP。

图7.用于肿瘤和转移瘤成像的ATP介导的NIR-II-BP。a）裸鼠中相同肿瘤的VIS生物发光成像、NIR-II荧光成像和NIR-II生物发光成像。b）T/N在不同的光学成像方法比较。c）在一只携带淋巴结转移的裸鼠上同时执行荧光成像和生物发光成像的示意图。蓝色箭头指示皮下注射位置。d）淋巴结转移的荧光成像（上）和生物发光成像（下），以及相应的高倍率成像（右）。e）沿淋巴管的强度分布图。f）腹膜转移瘤（编号1-7）的NIR-II荧光成像和NIR-II生物发光成像。g）f中相应序列号肿瘤的T/N比。h）f中转移性肿瘤（第1-7号）边缘的H＆E染色结果。可以观察到早期转移性病变与正常组织之间的所有边界。

张凡

复旦大学化学系、复旦大学先进材料研究院教授，博士生导师。国家杰出青年科学基金获得者、教育部青年长江学者、中组部青年拔尖人才。

张凡教授主要从事近红外光学分子探针的设计合成以及生物医学诊断分析的研究工作。发表SCI论文余篇，其中以通讯作者在Nat.Nanotechnol、Nat.Commun、J.Am.Chem.Soc、Angew.Chem.Int.Ed.、Adv.Mater.、Nano.Lett.等材料与化学相关国际一流期刊上发表了一系列有影响力的研究论文，引用超过0次，Hindex46。其中影响因子大于10的论文超过30篇，19篇论文入选ESI高被引论文，年入选科睿唯安全球高被引学者。撰写出版英文专著2部（英国皇家化学会出版社和德国Springer-Nature出版社）。

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