Nature淋巴结保护转移性黑色素

癌细胞，如黑色素瘤细胞，通常先通过淋巴系统区域性转移，再通过血液系统转移，而其原因尚不清楚。本文研究表明淋巴结中的黑色素瘤细胞比血液中的黑色素瘤细胞受到更少的氧化应激并形成更多的转移。人源黑色素瘤免疫缺陷小鼠和鼠源黑色素瘤免疫正常小鼠中肿瘤引流淋巴结内每微升的黑色素瘤细胞数比肿瘤引流血液内的多。与通过淋巴转移的细胞不同，通过血液转移的细胞会依赖铁死亡抑制剂Gpx4。用化学铁死亡抑制剂预处理的细胞通过静脉注射而不是淋巴结内注射比未处理的细胞会形成更多的转移。作者观察到淋巴液和血浆之间存在多种差异：淋巴结内具有较少的氧化应激和铁死亡，包括较高水平的谷胱甘肽和油酸，以及较少的游离铁。油酸以ACSL3依赖的方式保护黑色素瘤细胞免受铁死亡，并增加其形成转移肿瘤的能力。与来自皮下瘤的黑色素瘤细胞相比，来自淋巴结的黑色素瘤细胞对铁死亡的抵抗力更强，在静脉注射后形成更多的转移。暴露于淋巴环境可以保护黑素瘤细胞免受铁死亡，并增强其随后在血液转移中的存活能力。

图1淋巴结内油酸水平的升高抑制了转移性黑色素瘤细胞脂质ROS的积累和铁死亡，增加了其在血液转移中的存活能力。

1.增加淋巴结内黑色素瘤细胞的存活率

为了比较淋巴和血液中自发转移黑色素瘤细胞的数量，分别向NSG或C57BL小鼠皮下注射人或小鼠黑色素瘤，通过流式测定肿瘤引流血液和淋巴液，以及来自同一小鼠的远端血液和对侧淋巴中的黑色素瘤细胞数量。在人和小鼠的黑色素瘤中，每微升肿瘤引流淋巴液中的黑色素瘤细胞明显多于肿瘤引流血液中的黑色素瘤细胞，且对侧淋巴液中黑色素瘤细胞很少（图2a-b）。接下来，对淋巴液和血液中的氧化应激（ROS）水平进行了检测，结果表明在两种黑素瘤小鼠模型中，黑色素瘤细胞在血液中的ROS水平明显高于皮下肿瘤和淋巴瘤中的ROS水平（图2c-d），因此黑素瘤细胞向血液中转移与ROS显著增加相关，而向淋巴中转移则不相关。血液中的黑色素瘤细胞内谷胱甘肽/氧化型谷胱甘肽（GSH/GSSG）的比例显著低于皮下或者淋巴结内黑色素瘤细胞GSH/GSSG比,而GSH/GSSG比值在淋巴癌和皮下肿瘤的黑色素瘤细胞之间没有显著差异。（图2e-f）。同样的，淋巴液中GSH浓度和GSH/GSSG比值明显高于血液（图2g-i）。淋巴液中8-羟基-2-脱氧鸟苷（8-OHdG）氧化产物的浓度也较低（图2j）。

图2淋巴结中的黑素瘤细胞比血液中的黑素瘤细胞受到的氧化应激更少

2.黑色素瘤在血液中发生铁死亡

在多数人（图3a）和小鼠（图3b）黑素瘤模型中，血液中的黑色素瘤细胞的脂质ROS水平显著高于皮下肿瘤或淋巴瘤。为了验证黑素瘤是否会发生铁死亡，分别用Erastin（通过抑制胱氨酸摄取来促进铁死亡）和/或Liproxstatin-1（通过减少脂质过氧化物的积累来抑制铁死亡）对其进行处理。与对照组相比，Erastin显著减少了细胞数量，而Liproxstatin-1阻断了这一效应（图3c,d）。铁是铁死亡所必需的成分，可促进脂质ROS的产生。血浆中游离铁的浓度远远高于淋巴液（图3e）。为了验证铁死亡是否限制了黑色素瘤细胞在血液中的存活，用载体或Liproxstatin-1预处理黑色素瘤细胞，并将其静脉移植到小鼠体内。与载体预处理相比，Liproxstatin-1预处理显著增加了高转移率的人（图3f）和小鼠（图3g）黑色素瘤的转移。为了验证铁死亡是否影响黑色素瘤细胞在淋巴结中的存活，用载体或Liproxstatin-1预处理黑色素瘤细胞，并将其移植到小鼠窝淋巴结内。Liproxstatin-1预处理对结内注射后人（图3h）或小鼠（图3i）黑色素瘤的转移没有显著影响，这表明黑色素瘤细胞在淋巴结中的存活不受铁死亡的限制。用抗氧化剂N-乙酰-l-半胱氨酸或Trolox(维生素E类似物)预处理小鼠黑色素瘤细胞也显著增加了静脉注射后的转移率（图3j），但结内注射没有显著增加（图3k）。Gpx4通过减少脂质ROS的积累来抑制铁死亡,表达于本文所研究的所有人和小鼠黑色素瘤。Gpx4缺失的黑素瘤细胞皮下、静脉注射后在内脏器官形成转移瘤的百分比显著降低（图3l,m），但在结内注射后没有降低（图3n）。因此，Gpx4是血液中转移细胞生存所必需的，但淋巴中不需要。

图3与淋巴结相比，血液中的黑色素瘤细胞发生铁死亡的比例更高。

3.油酸可预防铁死亡

为了了解为什么黑色素瘤细胞在血液中发生铁死亡，而在淋巴中不发生铁死亡，将黑色素瘤移植到小鼠皮下，允许其自发转移，用流式对同一小鼠的血液和淋巴中分离的黑色素细胞进行代谢组学分析。主成分分析表明，来自淋巴的黑色素瘤细胞集中分布，而来自血液的黑色素瘤细胞较分散（图4a）。对淋巴和血液中黑色素瘤细胞的不同代谢物的路径富集分析表明前五条途径中有三条与脂质代谢有关（图4b）。检测了57种脂质，发现淋巴和血液中黑色素瘤细胞差异最大的脂质是油酸。油酸是一种单不饱和脂肪酸，它通过减少膜上可供氧化的多不饱和脂肪酸的数量或密度来抑制铁死亡。用油酸或亚油酸处理黑色素瘤细胞12h，然后用Erastin处理24h，并对活细胞进行计数。油酸或亚油酸本身对细胞计数几乎没有影响，而在人（图4c）和小鼠（图4d）黑色素瘤中，Erastin显著减少了细胞数量。油酸与Erastin共处理的细胞数并未减少，这表明油酸而不是亚油酸可以预防黑色素瘤细胞铁死亡。为了进一步验证油酸是否能促进黑色素瘤细胞在转移过程中的存活，用油酸、亚油酸或载体预处理黑色素瘤细胞12h，然后给小鼠静脉注射等量的活细胞。三种人黑色素瘤中有两种（图4e）以及两种小鼠黑色素瘤（图4f），接受油酸处理的细胞转移率明显高于载体或亚油酸处理的细胞。因此，油酸预处理促进了大多数黑色素瘤在血液转移过程中存活的能力。与NSG小鼠的血液相比，三酰甘油和磷脂中的油酸总水平在淋巴中比血液高1.9±0.3倍，而在C57BL小鼠中则高1.6±0.3倍（图4g,h）。为了验证油酸是否需要ACSL3（酰辅酶A合成酶长链家族成员3）来保护细胞免受铁死亡，油酸处理ACSL3缺失或亲代黑色素瘤12h，然后用Erastin处理24h，并对活细胞进行计数。油酸阻断了Erastin对亲代黑色素细胞的作用（图4d），却无法保护ACSL3缺失的细胞抵抗Erastin的作用（图4i,j）。

上述结果提出了淋巴结转移往往先于远处转移的可能性，因为接触淋巴液可使细胞吸收油酸和其他抗氧化剂，从而保护细胞在通过血液转移时免受铁死亡。为了验证这一点，从同一供体小鼠的原发性皮下肿瘤和淋巴结转移瘤中分离出小鼠黑色素瘤细胞，并通过静脉移植到二次受体体内。与来自皮下肿瘤的黑色素瘤细胞相比，来自淋巴结的黑色素瘤细胞更容易形成转移肿瘤（图4k）。为了验证这种差异的可逆性，从原发性皮下肿瘤和淋巴结转移中分离出黑色素瘤细胞，然后将细胞连续移植到皮下，然后静脉注射。短暂的皮下生长消除了淋巴结来源细胞相对于皮下肿瘤来源细胞的转移优势（图4k）。此外，在培养中，来自淋巴结转移的黑色素瘤细胞通常比来自皮下肿瘤的细胞对Erastin更具抵抗力（图4l,m）。

图4淋巴和淋巴黑色素瘤细胞中的油酸水平较高，油酸可以预防铁死亡。

总结

癌细胞可能通过血液发生转移（不依赖于淋巴结），但这条途径比通过淋巴结途径效率低得多，特别是在免疫能力较强的宿主中。本文研究的大多数(但不是全部)黑色素瘤在油酸处理后形成了更多的转移。这表明保护黑色素瘤免受淋巴结内氧化应激的机制并不依赖于外源性油酸，可能包括其他抗氧化剂水平的增加，内源性脂肪酸的产生或FSP1（铁死亡抑制蛋白1）介导的机制。总的来说，淋巴似乎通过减少氧化应激来保护转移细胞免受铁死亡，从而提高其在血液转移中的存活率。

文章来源：Ubellacker,J.M.etal.Lymphprotectsmetastasizingmelanomacellsfromferroptosis.Nature,,,-.

DOI:10./s---z.

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