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中国临床肿瘤学进展2014节选胃肠肿瘤
分子时代的胃癌个体化治疗
巴一
医院
胃癌是全球死亡第二位的恶性肿瘤，其与多种环境因素及致癌基因的突变相关。其中最为主要病因学的风险因素是幽门螺杆菌感染，但感染幽门螺杆菌的患者仅小部分最终发展为胃癌。随着对于胃癌发病的基因及表观遗传学认识的不断深入，使开发一种合适的生物标志物来反映患者个体化的特征从而降低胃癌死亡率成为可能。在分子研究方面的最新进展为胃癌的诊断与治疗带来了新的策略。
下一代测序（Next-generationsequencing，NGS）是一项可以一次并行对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定的技术，NGS方法为基因组，外显子组，表观基因组和转录组测序提供了新途径，使我们实现了对于疾病，包括肿瘤的全面了解，发现了相同病理亚型的恶性肿瘤中存在着较大的异质性。NGS技术在胃癌中的应用，使我们获得胃癌全基因组初步探索能力，在此篇综述中，我们总结过去对于胃癌遗传学及表观遗传学的相关报告，阐明NGS在未来应用中的可能，通过对突变基因的描述，形成应用NGS技术作为生物标记物和探索治疗靶点工具的基本框架。
微卫星不稳定性
微卫星不稳定性（MSI），是一种以简单的微卫星重复序列为特征的基因不稳定性。约15%的散发型胃癌存在微卫星不稳定性，从而最终导致表观遗传学的改变。DNA错配修复（MMR）基因的遗传及表观遗传失活最终导致了基因的突变表型。MSI构成一种独特致癌途径，MSI阳性（MSI+）胃癌患者无论临床、病理还是分子特征都与MSI阴性（MSI-）患者存在较大的差异。MSI主要积累位于编码区序列的肿瘤抑制基因或其他肿瘤相关基因的重复移码突变。非典型的MSI+胃癌还包括特定模式基因的失调。MSI+胃癌经常显示出一系列表观遗传变化，如各种基因的甲基化，包括关键MMR基因MLH1。MSI+与MSI-胃癌患者的基因型和表型之间的很可能与两者的在生物学及临床特性上的差异性相关。最近NGS分析发现MSI+患者的AT-rich互动领域1A（AT-richinteractivedomain1A，ARID1A）的频繁突变支持了这一观点。MSI+胃癌患者的临床病理学、遗传学、表观遗传学、预后及治疗变得越来越清晰，但仍需要进一步研究。因为目前临床靶向治疗中需要区分MSI+与MSI-患者的不同分子靶点，所以MSI状态的检测在基础肿瘤学和临床肿瘤学上均有着重要的意义。
Holbrook等分析50例胃癌患者标本并对个基因DNA进行深度测序，除了先前报道的属于不同通路的基因突变，作者还发现了一组可调控的靶点基因，如促甲状腺素受体基因及Rho激酶1（ROCK1）、Rho激酶2（ROCK2）。Wang等人对于22例胃癌患者的标本进行了外显子测序，发现染色质修饰上特异性基因及通路的突变。验证研究证实ARID1A基因的频繁灭活及蛋白缺失，此基因编码一种转换/蔗糖不可发酵（SWI-SNF）染色质重组复合物的亚单位。不同分子亚型的胃癌患者的ARID1A基因突变情况也不相同，MSI患者约83%存在突变，EBV病毒感染的患者中约73%突变，而非MSI及EBV感染患者中仅11%存在突变。此外，ARID1A突变与TP53突变负相关。同时ARID1A突变为胃癌的独立预后因素，以上均说明染色质重组在胃癌发病机制中的重要作用。
Zang等对15例胃癌标本进行了外显子测序，其中包括11例肠型腺癌，1例混合型，3例弥漫型腺癌及与其相匹配的正常DNA。TP53（11/15），PIK3CA（3/15）和ARID1A（3/15）存在突变。在频繁的基因突变中，细胞黏附是最常受到影响的通路。一项普遍筛查证实，钙黏蛋白家族成员FAT4突变发生在5%（6/）的胃癌患者中，FAT4基因组缺失发生在4%（3/83）的胃癌患者中。染色质重构基因（ARID1AMLL3和MLL）也被发现在47%的胃癌患者中存在突变。ARID1A突变存在于8%（9/）的胃癌，并同时存在PIK3CA基因及MSI的突变。在功能研究中，FAT4及ARID1A均显示出肿瘤抑制活性。体细胞FAT4和ARID1A的失活可能是某一亚型胃癌发生的关键因素。因为PI3K抑制剂目前已进入临床研究阶段，那么对于治疗有效的病例ARID1A基因状态是否会受到影响将是一项有趣的评价。
胃癌中ARID1A突变导致蛋白表达的缺失与EBV感染或MSI相关。Abe等研究了例胃癌标本ARID1A基因缺失情况，其中包括67例EBV+患者及MLH1缺失的MSI+患者。EBV+及MSI+患者的ARID1A缺失频率明显高于EBV-及MSI-患者。在EBV-/MSI-患者中ARID1A缺失与肿瘤大小，侵犯深度，淋巴结转移相关。而在MSI+患者中仅与肿瘤大小及弥漫型胃癌相关，在EBV+患者中均不相关。ARID1A基因表达缺失仅在EBV+的早期胃癌患者中可见，但EBV感染不会造成胃癌细胞系中ARID1A基因的缺失。因此，ARID1A基因缺失可能先于EBV感染存在于胃上皮细胞中。另一方面，ARID1A基因的缺失可能参与EBV-/MSI-胃癌的发展。综上，ARID1A基因的缺失在胃癌的发生过程中似乎存在不同的独立通路。
胃癌全基因组测序
为探索胃癌患者体细胞变化的完整列表，Nagarajan等结合大量平行短读及DNA双端测序对两例胃癌患者首次进行了全基因组分析，综合分析显示野生型KRAS基因的结构放大，在胃癌中是一个共同驱动因素。结合40例胃癌全外显子测序及另外94例点测序数据，发现在MSI+患者中ACVR2A，RPL22和LMAN1为循环性突变基因，而在TP53野生型胃癌患者中PAPPA为突变基因。这些结果突显出全基因组测序分析可以提供在基因测序中错过的特定组织相关致癌信息，胃癌患者的全基因组测序将会发现更多的循环改变基因。
MicroRNA为一组非编码RNA，可以调节基因转录后的表达水平，在许多生物过程及细胞通路中起着至关重要的作用。癌症中引发microRNA表达异常的原因主要包括，DNA拷贝的放大或缺失，不恰当的反式激活，癌基因或其他原因的转录抑制，microRNA转录后的调控失败及与启动子Gpg岛甲基化相关的基因突变或转录沉默。有越来越多的证据证明microRNA的改变在胃癌的发病机制中起着重要的作用。已发现大量的不同生物学功能的microRNA的改变与临床病理特征及预后相关。此外，microRNA作为临床微创诊断标志物及治疗的靶点的证据也被广泛的报道。最近的研究表明，肿瘤衍生microRNA稳定的存在于循环中，并且可以量化检测。目前microRNA为基础的治疗模式主要为以下两种：①对于癌基因的microRNA进行反义治疗；②通过其他技术修复具有抑癌作用的microRNA，不同亚型的MicroRNA（isomiRs）是成熟microRNA的天然变异体，全部isomiRs形成完整的microRNA组。因为NGS方法可以探测isomiRs的表达，因此在临床应用中NGS平台可以有效的识别microRNA的改变。Li等测定了胃癌患者的癌组织及非癌组织中的isomiRs，发现两组中microRNA表达情况明显不同，此外，作者还发现来自相同前microRNA的3p及5p端miRNA在癌组织及非癌组织中有着不同的组织倾向性，从而得出了一个全新的成熟miRNA选择调控机制。
全转录组学测定
第一个完整的胃癌全面RNA测序研究已在近期发表，Kim等利用全转录组学测定技术对24例胃癌标本及6例非癌标本进行了检测。同时还开发了一种多层综合分析方法来识别在转录过程中mRNA及miRNA的错误表达及循环突变。一个中心代谢调节基因AMPKa2（PRKAA2）及6个关键性miRNA（miR-d-3p，miR-20b，miR-b，miR--3p，miR-93andmiR-19a）被认为是胃癌的潜在功能性靶点。
在哺乳动物中，表观遗传调控在组织特异性基因的维持和发展中起着至关重要作用。表观调控的中断会导致基因功能的改变及恶性细胞的转换。近期癌症表观遗传研究揭示了胃癌各种表观遗传学机制的改变，包括DNA甲基化、组蛋白修饰、核小体定位、非编码RNA和miRNA。启动子CpG岛DNA异常甲基化会导致抑癌基因及其相关基因的失活，这是胃癌在表观遗传学上最主要的特征。不同生物学功能基因的大量甲基化与胃癌患者的临床病理特征及预后是明确相关的。在临床应用中，我们可以检测活检标本或血浆、胃灌洗液等无创性标本的异常DNA甲基化，例如CDH1，DAPK，GSTP1，p15，p16，RARβ，RASSF1A，RUNX3及TFPI2，来作为胃癌的生物标志物。利用全基因组亚硫酸氢测序及靶向性亚硫酸氢等NGS技术对DNA甲基化和组蛋白修饰进行检测，可以使我们进一步提高对于胃癌表观基因组学的认识。
启动子CpG岛超甲基化常与miRNA的沉默相关。Suzuki等分析了经DNA甲基化转移酶抑制剂5-氮杂-2′-脱氧胞苷（5-Aza-2′-deoxycytidine，5-Aza-CdR）处理的胃癌细胞系的miRNA，发现邻近CpG岛的超甲基化，主要表现为miR-34b及miR-34c基因沉默。在全部13个胃癌细胞系中均观察到miR-34b/cCpG岛甲基化，而在幽门螺杆菌感染阴性的样本中未见类似基因甲基化。对胃癌细胞转染miR-34b及miR-34c的前驱细胞，可以抑制其生长并改变其基因表达情况。值得注意的是，通过对例胃癌患者及85例健康患者非癌性胃黏膜分析显示多发胃癌的患者中甲基化水平明显高于单发胃癌及幽门螺杆菌阳性的健康患者，这一结果提示胃癌患者DNA甲基化主要表现为miR-34b及miR-34c肿瘤抑制基因的沉默，那么miR34b/c的甲基化有助于发现胃黏膜的表观遗传缺陷，并且可以作为多发胃癌高危风险的标志物。
早期胃癌经内镜下切除后，单从临床特征上很难判断是否出现了异时性胃癌，而非癌变胃黏膜的异常DNA甲基化是预测癌变的一个较为有效的标志物。Suzuki等评价了DNA甲基化作为预测异时性胃癌的临床应用性，全部例患者均为内镜下切除的早期胃癌患者，对于胃窦及胃体的非癌性胃黏膜进行采样，并对这些标本通过亚硫酸氢焦磷酸测序技术对miR-34b/c，SFRP1，SFRP2，SFRP5，DKK2及DKK3进行甲基化定量分析，然后运用Kaplan-Meier和Cox比例风险模型对于异时性胃癌风险进行预测。胃体部非癌性胃黏膜miR-34b/c、SFRP2、DKK2甲基化的患者发生异时性胃癌的累积风险明显高于非甲基化的患者，在其中miR-34b/c的甲基化被证明与异时性胃癌的发病风险明显相关，调整了性别、年龄、幽门螺杆菌状态、病理类型的多因素分析显示miR-34b/c甲基化是异时性胃癌的独立影响因素，作为标志物对于异时性胃癌的发生具有较好的预测作用及临床应用价值。
曲妥珠单抗是HER-2细胞外区域单克隆抗体，通过抑制其下游信号的传导来发挥抗肿瘤效应。在ToGA研究中，对于HER-2阳性的胃癌患者，曲妥珠单抗配合传统治疗方案（顺铂+5-氟尿嘧啶或顺铂+卡培他滨）与单纯化疗相比可使患者获得更长的生存期。HER-2的过表达及耐药机制成为了胃癌鐧界櫆椋庡亸鏂瑰揩鏈�濂界櫧鐧滈涓撶鍖婚櫌
