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中国临床肿瘤学进展2014节选黑色素瘤
黑色素瘤前哨淋巴结活检的若干问题
牛晓辉刘巍峰
医院
黑色素瘤的发病率逐年增高，近年来对该病的研究也不断有可喜的进展。众所周知，淋巴结转移是早期黑色素瘤预后的重要因素，大概20%中等厚度的病变出现区域淋巴结转移。正因为如此，确定哪些患者进行淋巴结清扫的预期获益大于手术并发症风险就变得尤为关键。前哨淋巴结活检（SLNB）在美国、加拿大、澳大利亚以及西欧普遍开展，并得到了美国癌症联合会（AJCC）的赞同，被评估为对黑色素瘤患者具有淋巴结转移临床风险的分期具有重要意义的手段。这种高精度和低风险的分期操作程序被用于指导手术治疗（如淋巴结清扫CLND和辅助治疗），对于临床试验的入组标准筛选同样具有指导意义。美国临床肿瘤协会（ASCO）与肿瘤外科协会（SSO）为此专门总结文献及两个协会历年会议纪要，发布了SLNB的指南文件，指出SLNB对于新发病例的淋巴结状态评估及分期是一种可接受的方法。结合国外的研究结果，医院医院展开协作，对国内的一批具备前哨淋巴结活检指征的患者进行了病例研究。
首先让我们来看ASCO和SSO专家组核心建议：
①SLNB是推荐用于中等厚度任何部位Breslow厚度为1~4mm的黑色素瘤，该方法是提供精确分期的推崇途径。②部分研究针对厚的黑色素瘤（T4；Breslow深度4mm）SLNB可能作为分期目的和利于局部病灶的控制。③目前没有足够的证据支持对于深度为T1（Breslow1mm）常规进行SLNB而获益，仅仅是对于部分选择性的高危病例，可能通过这种方法在分期上提早预知。④对于SLNB阳性的病例推荐进行CLND从而达到区域病灶的控制。对于SLNB阳性进行CLND后生存状况分析结果将通过选择性淋巴结清扫多中心Ⅱ期临床试验（MSLTII）揭晓和回答。
这些核心建议给目前的黑色素瘤SLNB总结了近20年来的经验和结果，并为其发展指出了明确的方向，为普及和提高运用SLNB指导肿瘤外科实践，在指南中还就这些核心建议进行一一说明。对SLNB的整个过程有了一个全面的阐述，包括文献的回顾、方法学研究、附加标准，以及各个中心的资料总结，这些均在ASCO官方网站能够查询到。①研究方法：ASCO和SSO的专家小组对所有的文献进行了系统回顾和荟萃分析。②文献搜索策略：对于年1月至年8月期间MEDLINE和EMBASE所有公开发表的文献进行总结，ASCO和SSO历年年会摘要也包括在内。③入组和剔除标准：所有研究必须要求报道SLNB病人手术数量，成功切除SLN数量，确认阴性的病例要求有持续随访记录。④非排除标准还包括Breslow厚度，研究类型，是否为前瞻性或回顾性研究。我们也希望以后的指南当中能够加入中国人的数据。
纵观该指南，ASCO和SSO成立的专家组指出本文目的在于回答两个根本性的问题：
（1）SLNB的指征是什么？
（2）CLND所扮演的角色是什么？
这也是我们自身在临床当中所遇到的两大医疗问题，即在什么情况下选择做前哨淋巴结活检，以及活检能够为患者带来的获益大小。
临床问题1?SLNB的指征是什么？
??指南推荐：
??中等厚度的黑色素瘤：建议常规进行，定位成功的比例很高，具有可接受的假阴性率，阳性预测值。
??厚的黑色素瘤：Breslow厚度大于4mm或T4的患者，SLNB推荐用于确定分期和利于区域病灶控制。
??薄的黑色素瘤：虽然对于选择性的高危病例可能获益，但是目前没有足够的证据支持对T1或者小于1mm深度的黑色素瘤常规进行SLNB。
??高危因素包括：溃疡和有丝分裂≥1/mm2，尤其是厚度为0.75~0.99mmBreslow深度的病灶。
指南解读：
文献系统回顾和荟萃分析表明SLNB是一项可行和准确的技术，荟萃分析统计其定位成功比例（PSM）预期达到97.4%~98.6%，而假阴性率（FNR）和检测后阴性率（PTPN）分别只有12.5%和3.4%，更支持这项可靠而微创的分期技术。97.5%的SLNB阳性病例接受了CLND，其中20.1%的病例发现有其他的阳性淋巴结。总的情况看，尽管几乎所有的患者接受了CLND，SLNB阳性患者局部复发率仍有7.5%。
更多新近的研究趋向于报道更高的PSM估计值，并展示了更多的技术进步和经验积累。由于严格的入组标准，许多SLNB单中心大样本结果报道的PSM和FNR并未包括在本荟萃分析之列。目前引用的FNR报道仅为0~2%，荟萃分析认为FNR将会随着随访时间延长而增高。总而言之，SLNB操作被认为是具有良好的耐受性和低的并发症发生率。
中等厚度的黑色素瘤：尽管临床变量如年龄已经被报道为低的危险因素，目前尚无能够可靠确定中等厚度黑色素瘤患者为低转移风险的特异变量。中等厚度黑色素瘤的定义各研究不尽相同，诚然，在临床上与分期系统是一致的，为1~4mm。
合并症：临床判断应当考虑SLNB患者是否有其他内科合并症。个体化的风险和获益在手术和麻醉评估时应当与可能导致死亡的潜在因素同等重视。
并发症：SLNB出现并发症的情况并不常见。MSLTI报道的总体并发症为10.1%，与之相对的是CLND32.7%的并发症。MSLTI报道SLNB最常见的并发症是积液（5.5%），感染（4.6%），伤口裂开（1.2%）。Sunbelt黑色素瘤临床试验（同样是前瞻性随机试验）显示了SLNB低的相似的总并发症（4.6%）和CLND（23.2%）。大部分并发症都是短期问题，通过伤口护理及选择性抗生素运用即可完全恢复。
分期：准确地确定淋巴结阴性（Ⅰ期和Ⅱ期）或淋巴结阳性（Ⅲ期）患者，可以极大便利区域病灶的控制和辅助治疗的开展。年制定的黑色素瘤分期指南较前有了实质性的改变，AJCC分期系统将分期与预后有效地联系起来。此时，淋巴结转移个数、以及淋巴结表现为隐匿病变或临床可见，都成为Ⅲ期患者预后独立预测因素。之后的年AJCC分期系统，进一步细化了N分类，基于区分微转移和宏转移（通过SLNB来诊断）对预后评估的价值。黑色素瘤宏转移能够被临床手段检测（非大小标准）及病理证实，而微转移是临床隐匿性淋巴结转移只能被病理医师通过显微镜单纯HE染色或免疫组化检测到，并不局限于尺寸的大小。当前的分期系统让我们认识到SLN检测转移病灶的价值（即使只有少数细胞的聚集），结合免疫组化。分子诊断，如反转录-聚合酶链反应，尚未被证明能够用于阳性淋巴结预后的检测，也未被用于确定阳性淋巴结。因此对于N分类的更多细化工作被运用于分类，分类中的显著差异来验证预后是否显著。例如5年存活率，只有一个SLN微转移阳性患者为70%而大于4个淋巴结转移则只有39%。
厚的黑色素瘤：虽然SLNB被广泛用于中等厚度的黑色素瘤病例。应用于厚的黑色素瘤具有一定的争议。传统观点认为深的病灶在诊断时即具有系统转移的高风险，且进行局部病灶切除仍不能取得生存获益。然而事实上对未出现远隔转移的深的病灶，有人主张其同样具有SLNB指征，以及从病理学证实可以从SLNB中获益。深的病灶进行SLNB的一个主要的优势在于更好的区域控制，这对于超过30%几率发生淋巴结受累的人群意义尤其重大。
薄的病灶：在全美黑色素瘤新发病例大部分（70%）为薄的病灶（T1，1mm）。一般来说，常规进行SLNB并不提倡，因为淋巴结受累总的风险仅有5.1%，尽管有报道表明阳性SLN在某些亚群中薄的病灶中最高可达到20%（尤其是介于0.75-0.99mm深度伴有溃疡和/或有丝分裂≥1mm2）。薄的病灶进行SLNB的个性化治疗在许多治疗中心是基于危险因素与转移的关系。
中国的黑色素瘤专家委员会制定出了详细的中国恶黑前哨淋巴结活检指征，主要为Breslow厚度大于1mm或者合并局部溃疡。
临床问题2?CLND所扮演的角色？
??指南推荐
??推荐用于SLNB阳性病例，可以达到局部病灶的控制，目前正在进行的MSLTII期临床试验将揭晓CLND对于SLNB阳性患者最终是否提高总生存率。
指南解读：
文献回顾和分析：CLND是标准推荐用于SLNB阳性的。MSLTII的目标是确认对于已经摘除阳性淋巴结的患者，是否能够从对非前哨淋巴结进行清扫中获益。在MSLTI中，淋巴结转移的患者早期干预相对那些临床出现明确转移证据再进行晚期清扫的患者有生存优势。因此，即使CLND的两大目的是局部控制和治愈，目前仍然没有足够的证据确定如果CLND有遗漏仍然是安全的。
如果不进行CLND区域淋巴结的复发风险：在两个大的前瞻性随机试验中，SLN阳性进行CLND后非SLN阳性比例为16%，在一项回顾性的多中心研究中，其中包括例高选的SLN阳性而未行CLND患者，15%的患者出现区域淋巴结转移。因此，从这些数据可以得到一个合理的解释，未行CLND的患者区域淋巴结转移的风险至少为15%-20%。
CLND区域病灶的控制：在MSLTI中CLND后区域淋巴结复发率为4.2%，在Sunbelt试验中为4.9%（未发表数据）。这些几率远低于最先出现转移部位的区域淋巴结15%的复发率，以及Wong报道的未行CLND患者41%的的区域淋巴结复发率。
在得到MSLTII的最终数据之前，我们没有一个高水准的证据确定CLND对区域病灶控制的影响到底有多大。只有到了MSLTII揭晓，才有最好的证据表明CLND对于大多数SLNB阳性患者区域病灶控制的有效性。
CLND对于总生存的影响：MSLTI显示CLND对总生存并无获益，可能是因为SLN阳性患者只占少数（16%），研究中的大部分患者并未从区域淋巴结切除中获益。然而，对于5年生存率，SLN阳性患者接受CLND为72.3%，而那些未进行SLNB进而发展为可触及的淋巴结包块则为52.4%（P=0.）。
SLNB技术主要包括三大要点：术前核医学显像技术、手术操作，以及术后病理学技术。
指南解读：前哨淋巴结活检技术，SLNB的成功依赖于多学科的合作，核医学、外科和病理科。放射性胶体注射后淋巴显像不仅确定淋巴引流SLN位置，并且确认潜在的可能受累的淋巴区域。蓝染剂注射与放射性胶体联合运用于淋巴结探测犹如按图索骥。微转移的确认依靠病理科的彻底评估，包括连续切片和免疫组化。
术前淋巴显像
术前淋巴显像是核医学科经典的围术期计划，从原发黑色素瘤发出的淋巴引流变化不定，尤其是头颈部和躯干。引流到多个淋巴区域将被确定，淋巴显像将被用于引导对受累区域恰当的活检，以及引导手术中间隔识别淋巴结，这些有时或许就是该淋巴结转移的唯一途径。
在原发黑色素瘤病灶周缘进行4点皮内注射锝99标记的硫胶体（99mTc-sulfurcolloid）0.05~1mCi，然后进行术前淋巴显像，可以得到淋巴结可视化的适时图像，许多中心在手术当日进行淋巴显像，那么则有足够的时间检测放射性胶体，因为锝99标记的硫胶体半衰期为6个小时。当原发肿瘤与淋巴池非常接近（如颈部），那么确定离散的引流相对困难，在这种情况下，额外的解剖标识将被辅助用于识别淋巴池显影和原发肿瘤注射部位的浓集。
放射性胶体制剂：各个研究中心所使用的放射性胶体制剂不尽相同。99mTc-sulfurcolloid在美国普遍运用，锝99标记的纳米胶体（99mTc-nanocolloid）和三氧化二锑胶体（99mTc-antimonytrisulphidecolloidal）在美国以外的中心应用较多。一般情况下，颗粒直径越小，其循环更快，显像的淋巴结个数越多。正是由于这个原因，美国许多研究中心制备胶体时需要进行筛选，通过0.22微米过滤器从而保证颗粒注射前大小的一致性。更多的中心首选皮内注射，因为这与恶性肿瘤细胞潜在转移途径更相似。而皮下注射后组织张力不足可能导致引流延迟。为避免给真皮淋巴管过高压力，注射容积掌握恰当很重要，保证相对小的注射量，首选大约0.1ml。值得注意的是，tilmanocept作为一种新的淋巴显像剂正在研究中并在Ⅱ期和Ⅲ期临床试验中得到验证。
辐射安全问题：伽马相机和伽马探测仪都是极其敏感的，只需要非常细微的放射活性即可成功完成整个流程。0.05~1mCi剂量即足够，这相当于约99mTc-MDP骨扫描剂量的1/20。据估算，一名外科医师手指接受单个SLN手术放射剂量相当于全身每年基础辐射量的1/30。
成像：几乎所有研究中心都会在患者注射药物后手术前采用伽马相机进行成像确定受累淋巴结位置。这特别是在上肢和下肢远端黑色素瘤，肱骨内上髁或腘窝淋巴结可能受累，躯干黑色素瘤则对侧淋巴结较同侧更易受累，头颈部则在耳前，腮腺或者枕下淋巴结先于颈椎旁和锁骨上窝受累。许多中心进行了动态成像的采集来确定淋巴结的引流情况。如果不进行动态采集，则有可能出现淋巴管终末端浓集而在单平面影像上误诊为受累节点。目前有许多辅助的方法来协助确认受累淋巴结位置，SPECT-CT开始运用于成像研究，尤其是头颈部黑色素瘤，由于其解剖结构复杂以及注射部位与显像部位相当接近。
医院自年3月至年4月共进行前哨淋巴结活检58例，术前4~6小时在病灶周围注射1~2mCi的锝99m标记的右旋糖苷，注射后30分钟、2小时、4小时行核素显像，均获得良好的前哨淋巴结的显像图，术后共有10例患者前哨淋巴结阳性。
SLNB的操作细节
术前注射99mTc-sulfurcolloid和蓝染剂，术中通过手持伽马射线探测仪常规进行淋巴绘图显像和SLNB操作。在手术室，蓝染剂被常规运用，通常在手术野消毒后进行注射，约5到10分钟即可达到受累淋巴结区域。目前可用的蓝染剂主要是isosulphan和methylene。1~2ml蓝染剂被注射于原发肿瘤周缘皮内，蓝染剂在皮内顺利引流至关重要，因为皮下注射可能会因为脂肪对放射活性物质或蓝染剂摄取不足而不能进入淋巴管通道。Methylene被报道有组织坏死相关性，所以使用时应当考虑手术时可以将蓝染区域连同原发病灶一并切除。但是大部分的蓝染部分并不能通过手术切除（如脸，眼眶周围，手腕和脚踝），可以对蓝染剂进行稀释降低坏死风险，少量的蓝染剂若不随原发灶切除可能称为永久的文身。此外，由于机体的循环，蓝染剂会24~36小时在尿液，粪便甚至母乳中出现。
结合术前的淋巴显影图，手持的伽马探测仪可以精确探测到摄取了放射性胶体的淋巴结位置，外科医生通过探测仪和蓝染的淋巴管即可按图索骥找到SLN。极小的切口即可以完全将受累的SLN进行摘除。每个摘除的SLN都将在体外被检测放射读数，然后淋巴野将会被再次扫描是否还有高计数的淋巴结，一般来说，任何蓝染的淋巴结，任何放射计数≥本群淋巴结最高计数10%的淋巴结，以及可触及到的肿大的淋巴结都应一并切除。随着操作技术的进步和探测仪器的精确性改进，我们在进一步的临床治疗中仅采用同位素探测即可以取得较好的效果，略去了亚甲蓝（美蓝）注射的步骤，从而精简了操作流程，减少了美蓝可能导致的局部皮肤和软组织的并发症。
根据SLNB操作的指南建议，我们摘取了医院年3月至年5月期间收治的35例前哨淋巴结活检进行了统计分析，男19例，女16例。中位年龄为58（29~89）岁。原发病灶：手部8例，足部27例。35例中有24例原发病灶有溃疡。35例患者Breslow厚度均1mm，区域淋巴结均行B超、MRI、或全身的PET-CT检查除外转移，35例均行前哨淋巴结活检术。核素扫描我院使用的前哨淋巴结显像剂为锝99m标记的右旋糖苷。在术前4~6小时在病灶周围行4点注射，剂量为2mCi。注射后30分钟、2小时、4小时行全身扫描，确定前哨淋巴结的位置，并行体表标记。消毒前先用Neoprobeγ射线探测仪再次确定前哨淋巴结的位置。术中在γ射线探测仪的帮助下切取前哨淋巴结。病理检查淋巴结每3mm一层切片，行HE染色和HMB-45，S-，Melan-A免疫组化染色。结果阳性拟行淋巴结清扫术。
结果显示核素扫描在注射锝99m后30min可被发现，核素自原发灶沿淋巴管向区域淋巴结扩散；注射后4小时前哨淋巴结显像稳定。35例患者核素扫描均发现1~3枚不等淋巴结。8例手部黑色瘤中2例滑车上淋巴结和腋窝淋巴结同时显像，其余6例仅腋窝淋巴结显像。27例足部黑色素瘤患者，5例窝和腹股沟淋巴结同时显像，其余22例仅腹股沟部淋巴结显像。所有显像的前哨淋巴结均切取出淋巴结，淋巴结个数为1~3个，检出率为%。本组35例中有5例足部黑色素瘤患者，其腹股沟前哨淋巴结病理检查为阳性，阳性率为14.3%。此5例均行腹股沟淋巴结清扫术。并发症为1例患者术后伤口出现皮瓣坏死，1例患者出现伤口感染，经再次手术后痊愈。
SLN的实验室病理评估
大部分的标本包括1~3个淋巴结，根据其蓝染情况和放射性摄取考虑为SLN。SLNB提供有限而可疑目标程度更高的标本量，较淋巴结清扫的大量淋巴结而言利于进行更加详尽的检查。SLN的最长径、宽径，以及厚度均以mm单位测量，通过最长径切开，此时行印片细胞学检查。指南建议每张切片的厚度建议为2mm。组织置于甲醛溶液浸泡12~24小时。
核医学和外科医生在标本送检前最好能够确定哪一个是真正的SLN，因为偶尔的技术问题可以导致误判。标本送到实验室后蓝染剂几乎很难辨认，放射性计数也会因半衰期而迅速衰减，并且很少有病理实验室具有探测仪等工具。
评估SLN：SLN最好是通过石蜡切片评估。冰冻切片不建议用于单独诊断，因为依靠病理医师术中短时间立即作出诊断是不可靠的，且对于整个淋巴结需要有全面的评估，单纯几张切片判定是不够的，因为有的病例仅仅是一簇细胞甚至是单一的黑色素瘤细胞。对于痣细胞的冰冻切片判定更加困难。
SLN的多层次评价：多个切片进行HE染色和免疫组化评价。对于染片的多少和切片的间隔距离至今仍有争议。早期研究建议对于早期黑色素瘤转移可以经过长的径线切片来确认，基于这些早期的认识，建议对两半淋巴结各进行连续10个连续切片。如果在最初的切片未发现肿瘤细胞，对于认为有高转移风险的淋巴结需要进行补充切片，这种方法检测出黑色素瘤约占16%~20%，接近原发病灶广泛切除后淋巴结转移的发生率。目前欧洲癌症研究与治疗组织对所有进入临床试验的患者要求6对50μm间隔的切片，进行HE染色和S-组化分析。
SLN组织的研究：SLN的准确判断对于优化患者治疗极为重要，但是对于有限的转移可能很难发现。由于需要根据SLN转移与否预判患者的预后，病理医师应当高度谨慎处理标本，直到SLN得到了充分采集并运用于研究。因此建立一项技术如适时聚合酶链反应，达到真正检测少量临床相关的肿瘤即可确定诊断，而不是依靠传统组织病理学确定似乎是一个合理的需求。其他研究包括分子和细胞水平研究确定SLN易感性。一部分用于病理学，一部分用于研究，相对福尔马林标本，提供非固定组织是富有挑战性的，由于这些研究需要新鲜的病理组织，病理医师和研究者还需要了解诊断组织的要求和人体组织监管规定。
免疫组织化学：即使是有经验的病理医师只通过单纯HE染色诊断，导致疏漏单个黑色素瘤细胞或小簇黑色素瘤细胞比例可达到12%。对S-抗体检测细胞核与细胞质几乎在所有黑色素瘤都表达。虽然具有非特异性，结合经验，对于黑色素瘤的区分还是具有相当高的一致性。MART-1，HMB-45，抗酪氨酸酶抗体检测均得到运用，特异性高于S-，但是只有约25%的黑色素瘤表达，尤其是转移性黑色素瘤。
总而言之，前哨淋巴结活检技术对黑色素瘤的分期、治疗及预后有明确的指导意义，我们需要严格把握好手术指征，以及在操作后仔细的病理学分析来进行评判，指导临床工作。
英文缩写对照：
