VEGFCVEGFDVEGFR3

于浩张师前

在肿瘤转移机制的研究中，淋巴系统作为肿瘤尤其是实体瘤转移通道的重要意义不断被认识。临床病理学研究显示实体瘤播散的最早途径是经淋巴道的区域性淋巴结播散。目前大多数研究都认为，VEGF-C、VEGF-D/VEGFR-3信号系统是肿瘤淋巴管生成最重要的调控机制，并在肿瘤淋巴转移过程中发挥了重要作用。

1.VEGF-C、VEGF-D/VEGFR-3信号系统

VEGF-C首先由Joukov等[1]于年利用受体亲和色谱法在PC-3前列腺腺癌细胞培养液中发现的一种能刺激受体VEGFR-3酪氨酸磷酸化的因子，随后被分离纯化，证实是VEGF的一种新同源物，命名为VEGF-C。人VEGF-C基因40kb，定位于染色体4q34，其蛋白由个氨基酸残基构成，属分泌性多肽，经蛋白水解加工后，形成以二硫键连接的同源二聚体，可与其相应的受体结合而发挥生物学效应。正常人体组织中，VEGF-C仅在成人呼吸道和消化道黏膜内分泌细胞中有少量表达。VEGF-D是年Achen等[2]用计算机进行同源搜索时发现的，与VEGF-C结构相似，定位于染色体Xp22.31。VEGF-D与VEGF-C在人体结合相同的内皮细胞受体，其蛋白水解程序与VEGF-C相同，蛋白水解程序可以调控VEGF-D的生物活性。VEGFR-3最早从人胎盘和红白血病细胞基因库中克隆出来，定位于染色体5q33-5q35，与VEGFR-1、VEGFR-2同属于受体型酪氨酸蛋白激酶家族。VEGFR1和VEGFR2主要表达于血管内皮细胞，VEGFR-3主要表达于淋巴管内皮细胞。所有VEGFR都具有相同的7个细胞外免疫球蛋白同源区域，其中第2和第3个区域是配体结合的关键部位，并且前3个区域是建立完整结合的必须条件。VEGF-C、VEGF-D/VEGFR-3信号系统通路基本转导途径为：VEGF-C或D与VEGFR-3结合后，VEGFR-3发生磷酸化并激活结联蛋白，使后者的SH2区与PTB区结合而发生自身磷酸化,磷酸化的结联蛋白可与调节蛋白Grb2的SH2区结合，并促进Grb2的SH2区与尿嘌呤核苷酸释放因子SOS结合形成复合体，此复合体激活Ras信号转导途径，最终诱导细胞有丝分裂，促进细胞增殖[3]。

2.VEGF-C、VEGF-D/VEGFR-3旁分泌作用与肿瘤淋巴转移

动物试验研究发现,在高表达VEGF-C或VEGF-D的动物肿瘤模型中，肿瘤组织中淋巴管生成增加，表现为淋巴管内皮细胞增殖，肿瘤组织淋巴管密度明显增高，并与淋巴结转移相关。Skobe等[4]将VEGF-C转染入人乳腺癌细胞株MDA-MB-中，建立高表达VEGF-C的裸鼠动物模型，并以LYVE-1标记淋巴管，研究发现：与对照组MDA-MB-/GFP裸鼠相比，实验组MDA-MB-/GFP–VEGF-C裸鼠移植瘤淋巴管内皮细胞增殖明显，管腔扩张，淋巴管密度增加，淋巴结转移增高，因此认为作为一种淋巴管生成因子，肿瘤细胞高表达的VEGF-C能够促进肿瘤淋巴管生成和淋巴结转移。Mattila等[5]将VEGF-C转染入一种低侵袭性的、雌激素依赖的乳腺癌细胞株-MCF-7，建立高表达VEGF-C的小鼠动物模型。研究发现，与空载体组小鼠MCF-7-Mock相比，MCF-7-VEGF-C组小鼠无论是肿瘤组织内部淋巴管密度还是肿瘤组织周围淋巴管密度均明显增加，且区域淋巴结转移阳性。与VEGF-C相比，在肿瘤淋巴管生成方面有关VEGF-D的研究还较少。Stacker[6]利用一种不表达VEGF、VEGF-C和VEGF-D的细胞株EBNA，建立高表达VEGF-D的VEGF-D-小鼠模型。研究发现：在小鼠移植瘤周围LYVE-1阳性管腔明显增多，形态学上与血管明显不同，呈簇状聚集在肿瘤实质周围，进一步研究发现其大多数同时也表现为VEGFR-3阳性，证明这些肿瘤周围增多的脉管为肿瘤新生的淋巴管，而且通过注射染料法发现这些淋巴管其功能上都是完整的。最近，VonMarschall[7]等将高表达VEGF-D的人类胰腺导管癌细胞接种到裸鼠上，以LYVE-1标记，结果也发现VEGF-D可以诱导肿瘤组织内部和肿瘤组织周围淋巴管生成，并与显著增加的淋巴脉管浸润和淋巴结转移率相关。因此作为一种淋巴管生成因子，VEGF-D同样也在肿瘤淋巴管生成和淋巴转移中扮演了重要角色。

对人类许多肿瘤的临床研究也证实，高表达的VEGF-C或D与肿瘤患者淋巴结转移、淋巴管浸润以及不良预后相关。Hashimoto等[8]对75例子宫颈癌患者进行研究，发现在磁共振诊断为盆腔淋巴结转移阳性的患者中，VEGF-CmRNA表达显著增高，子宫颈癌组织中VEGF-C的表达与盆腔淋巴结转移、间质浸润深度以及脉管浸润显著相关，认为VEGF-C在子宫颈癌淋巴结转移过程中发挥了作用，对活检组织检测VEGF-C的表达可能有助于预测患者是否已发生盆腔淋巴结转移。Beasley等[9]在研究头颈部肿瘤中发现，淋巴管在肿瘤内分布呈散在的热点区，淋巴管内皮细胞增殖核抗原染色阳性，其管腔小，管壁由2到3个内皮细胞构成，有些仅成腔隙状，形态与肿瘤组织周围原有的淋巴管也有所不同，肿瘤内淋巴管密度与淋巴结转移呈正相关。这就表明肿瘤内存在着淋巴管生成，并与肿瘤淋巴转移相关。

因此，动物实验和临床研究的结果证实VEGF-C、VEGF-D/VEGFR-3信号系统在肿瘤淋巴转移过程中发挥了重要作用。目前研究认为其机制可能是：肿瘤细胞分泌淋巴管内皮生长因子VEGF-C、D以旁分泌的形式作用于淋巴管内皮细胞上的酪氨酸激酶受体VEGFR-3，经过信号传导，最终引起淋巴管内皮细胞的增殖、分化、迁移和管腔形成，肿瘤组织淋巴管密度增加。这些肿瘤组织内增多的淋巴管与生理状态下的淋巴管结构相似，但数量增多，管壁薄，多位于肿瘤实质周围，因此这就为肿瘤细胞浸润转移提供了更多的通道，有利于肿瘤细胞转移扩散和淋巴结转移。除此以外，VEGF-C、D与VEGFR-3结合后能够促进淋巴管内皮细胞释放蛋白水解酶类，促进肿瘤细胞的基质浸润[10]，同时还可改变淋巴管内皮细胞的黏附特性、表面趋化因子及其受体的表达，影响肿瘤细胞进入淋巴管的过程，从而主动促进肿瘤淋巴管转移[11]。但对于肿瘤淋巴管生成的方式，目前尚无定论。肿瘤组织中新生淋巴管可能来源于骨髓中的内皮祖细胞，也可能直接来源于组织中既存淋巴管，甚至可能由其他细胞转化而来。骨髓内皮祖细胞是来源于循环内皮细胞系统的一个亚群，表达CD34和VEGFR-2。在诸如肿瘤的病理情况下，机体循环中内皮祖细胞的数量会增加，并可渗入血管内皮细胞之间与其融合，参与肿瘤的血管生成。Salven[12]等研究发现，部分内皮祖细胞在表达CD34和VEGFR-2的同时还表达淋巴管内皮标志物VEGFR-3，因此推测这部分细胞可能为淋巴管内皮细胞祖细胞，并以上述肿瘤血管生成的方式参与肿瘤淋巴管生成。另有研究发现[13]，机体巨噬细胞不仅可以刺激组织中既存的淋巴管内皮细胞分裂增生，而且还可以进入组织间质中，直接转化为淋巴管内皮细胞簇并与组织中既存的淋巴管相连接。这就揭示，某些细胞可以通过转化的方式转变为淋巴管内皮细胞，进而形成新生淋巴管。但目前多数研究认为，肿瘤组织新生淋巴管是由组织中既存的淋巴管以“出芽”方式形成的。He[14]等通过比较骨髓内皮祖细胞和组织既存淋巴管对肿瘤淋巴管生成所起作用时发现，在肿瘤淋巴管生成的过程中，新生的淋巴管主要来源于组织中既存的淋巴管，骨髓内皮祖细胞的作用很小。

3.VEGF-C、VEGF-D/VEGFR-3自分泌作用与肿瘤淋巴转移

尽管肿瘤组织淋巴管生成，增多的淋巴管密度为肿瘤细胞提供了更多的转移通道，在肿瘤淋巴转移过程中发挥了重要作用，但肿瘤细胞淋巴转移是一个包括了诸如迁移、基质降解、定位等一系列步骤的复杂过程。肿瘤细胞侵袭迁移是实现肿瘤浸润转移的必要条件。VEGFR-3作为VEGF-C/D的受体，除主要表达于淋巴管内皮细胞以外，在肝、脾血窦、创伤修复以及肿瘤组织新生的血管内皮中也有表达。最近的研究结果表明许多肿瘤细胞本身也表达VEGFR-3。肿瘤细胞分泌VEGF-C、D，以自分泌的形式作用于其自身上的受体VEGFR-3，通过影响肿瘤细胞的生长、增殖、迁移等不同作用形式，在肿瘤淋巴转移过程中也发挥了重要作用[15]。Su等[16]体外迁移和侵袭试验研究发现，某些具有强侵袭能力的肿瘤细胞，如子宫颈癌细胞系SiHa，除表达VEGF-C外，还存在VEGFR-3的表达。人重组体VEGF-C蛋白（CysSer）能够促进肿瘤细胞迁移和侵袭，而应用重组体VEGFR-3/Fc阻断VEGF-C的作用后，细胞迁移和侵袭能力大大下降。这就表明VEGF-C、D/VEGFR-3除了以旁分泌的作用形式实现肿瘤淋巴管生成外，还以自分泌的作用形式促进肿瘤细胞的迁移和浸润，两者相互作用最终实现肿瘤淋巴转移。Weninger等[17]应用免疫组织化学研究显示卡伯希肉瘤肿瘤细胞表达VEGFR-3。Marchio等[18]进一步研究发现，VEGF-C重组蛋白或CS突变体VEGF-C重组蛋白能激活卡伯希肉瘤肿瘤细胞表达的VEGFR-3，后者酪氨酸磷酸化增加，肿瘤细胞增殖和迁移能力增强，并且这种改变与VEGF-C重组蛋白或CS突变体VEGF-C重组蛋白的剂量相关。肿瘤细胞在浸润转移过程中，由于机体免疫攻击、炎症因子等因素的作用会发生凋亡。VEGF-C/VEGFR-3能够提高肿瘤细胞自身的生存能力。Masood等[19]发现VEGF-C/VEGFR-3激活后还有促进恶性间皮瘤生长的作用，相反，应用VEGF-C反义寡核苷酸、重组VEGFR-3/Fc或VEGFR-3抗体抑制VEGF-C/VEGFR-3信号传导系统的作用后，恶性胸膜间皮瘤细胞生存能力明显下降。不仅如此，Dias等[20]研究还发现，激活的VEGF-C/VEGFR-3系统还能够增强白血病细胞的耐药性，使其逃脱阿糖胞苷、足叶乙甙、柔红霉素等化疗药物的诱导调亡作用。VanTrappen等[7]研究发现在从子宫颈上皮内瘤变进展为子宫颈浸润癌的过程中，VEGF-C、D/VEGFR-3表达不同，因此推测其可能还参与了宫颈癌变过程中的促淋巴管生成表型的转变，使得子宫颈癌早期即可发生淋巴转移。

4.总结

VEGF-C、D/VEGFR-3一方面通过旁分泌作用机制促进肿瘤淋巴管生成而为肿瘤细胞转移提供通道，另一方面通过自分泌作用机制促进肿瘤细胞生长、增殖、迁移，从而在肿瘤淋巴管生成和淋巴结过程中起到了重要的调控作用。这也就为抗肿瘤淋巴管生成和淋巴转移的基因治疗提供了可能的靶点。Lin[21]等将Caki-2接种到裸鼠身上建立动物模型，将腺病毒介导的可溶性VEGFR3（sVEGFR3-Fc）载体转染到肿瘤细胞中，观察其对肿瘤淋巴管生成和淋巴结转移的影响。结果发现：在空载体裸鼠组，肿瘤周围引流淋巴管管腔增大，并且数目增多。而在sVEGFR3-Fc治疗组裸鼠肿瘤相关淋巴管未见扩大，并且发生转移的淋巴结数目也减少。但由于肿瘤淋巴转移机制十分复杂，研究发现除VEGF-C、D/VEGFR-3信号系统以外，许多因子也直接或间接参与了肿瘤淋巴管生成和淋巴转移的过程，如VEGF-A[22]、血小板源性生长因子家族[23]、肝细胞生长因子[24]等，因此单纯阻断VEGF-C、D/VEGFR-3信号系统并不能完全实现对肿瘤淋巴转移的抑制。目前对于肿瘤淋巴转移的研究还停留在基础层面，还有许多疑问未被解决，研究结果之间也存在诸多争论，但相信随着对肿瘤淋巴管生成和淋巴转移调控机制研究的深入，抑制肿瘤淋巴管生成和淋巴转移，一定能够为肿瘤淋巴转移的治疗开辟一条新的途径。

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