上皮性卵巢癌分泌的外泌体的miR222

题目：上皮性卵巢癌分泌的外泌体的miR--3p诱导肿瘤相关巨噬细胞的极化。

摘要：癌症分泌的外泌体的miRNA产生作为肿瘤与基质见相互沟通的介质。我们发现上皮性卵巢癌（EOC）来源的外泌体激活巨噬细胞成为肿瘤相关巨噬细胞（TAM）样表型，这个过程涉及了SOCS3/STAT3通路，这个通路可以促进癌症的进展。miR--3p在EOC细胞释放的外泌体中富集，以及它可以被转运到巨噬细胞。miR--3p在巨噬细胞的过表达诱导M2表型的极化。荧光素酶分析已经证实miR--3p靶向SOCS3基因，以及转染miR--3p类似物后发现SOCS3基因的表达减少。SOCS3的下调造成激活的STAT3的表达增加。miR--3p可以在来自血清的外泌体中检测到，以及它的水平与EOC相关。这些观察到的现象都说明肿瘤来源的外泌体的miR--3p在促进肿瘤生长的M2巨噬细胞的极化过程中时一个有效的调节因子，它可能是EOC的一个生物学指标。

背景介绍：上皮性卵巢癌（EOC）是女性癌症死亡原因的第五位，大多数EOC病人确诊时已经是晚期了。因此，阐明EOC发展的分子机制对于发现一个早期诊断途径和新的靶向治疗是十分必要的。

逐渐得到共识的是：癌症应该被考虑为一个复杂的微环境，这个复杂的微环境，而不是单个肿瘤细胞，在肿瘤的进展和转移中扮演了重要的角色。巨噬细胞表现出多种多样的表型和功能，它在肿瘤环境中时数量最多的免疫相关的基质细胞。我们先前的研究表明凝血酶和凝血因子XII可以调节单核细胞向肿瘤相关巨噬细胞分化，从而促进EOC的腹膜转移。刺激辅助T细胞（Th）1和Th2可以激活巨噬细胞向经典的M1表型转化，或者选择性的向M2表型转化。肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）浸润肿瘤往往被认为更像M2表型。然而，导致巨噬细胞表型改变的机制仍然是未知的。

外泌体，它是直径30到nm的微囊泡，它是内吞作用过程中形成的，已经被报道通过转运基因内同屋成为肿瘤和基质细胞的细胞间沟通的重要介质。最近，许多研究表明来自各种类型细胞的外泌体在免疫调节中扮演重要的角色。比如，在具有恶性胶质瘤的人类和老鼠，DC细胞诱导CD8T细胞依赖的抗肿瘤效应，用肿瘤来源的外泌体。来自肿瘤的外泌体促进T细胞功能失调和人类鼻咽癌的进展。在卵巢癌，来源于病人腹水的外泌体可以诱导DC细胞前体的凋亡。Szajniketal.发现卵巢癌病人的血浆来源的外泌体促进了Treg（调节性T细胞）的功能，这类细胞可能促进癌症的免疫逃避。

JAK/STAT通路的激活在巨噬细胞分化和极化的过程中扮演了很重要的角色。SOCS3是JAK/STAT信号通路中的一个负性反馈调节因子，它可以调节巨噬细胞M1和M2的极化。TargetScan预测SOCS3的3’端很可能被miR--3p所靶向。miR--3p在各种肿瘤类型中都有过度表达，包括卵巢癌。而且，我们的研究证实了EOC病人血清来源的外泌体中表达更高水平的miR--3p。

在这个研究中，EOC来源的外泌体包括诱导巨噬细胞朝M2样表型极化的现象已经被观察到了。而且，潜在的那些可能有助于治疗和发现EOC的机制已经被重视。

结果：

图一：发现Skov3分泌的外泌体以及这些外泌体被受体细胞内化。A，Skov3细胞来源的外泌体的透射式电子显微镜（TEM）图，发现这些外泌体的大小从30nm到80nm不等，具有杯状外形。B，CD63为外泌体存在的标记物。通过CD63的免疫沉淀发现CD63在外泌体中比较多。C，将外泌体进行荧光染色，然后与未染色的巨噬细胞一起培养。用共聚焦显微镜观察发现，巨噬细胞膜被染色了。

图二，在活体和试管内，EOC细胞来源的外泌体会激活巨噬细胞朝着TAM样表型转变，这个过程可以促进EOC的演进。巨噬细胞加入EOC来源的外泌体或者PBS进行培养。

A和B图，48小时，与对照组相比，当与Skov3来源和A来源的外泌体共培养时，CD（M2的表面标志物）升高。而且，Arg-1的表达表明增加了向M2的趋势，然而MCP-1的表达表明减少了向M2转变的趋势。图A发现与Skov3来源的外泌体共培养时Arg-1增加MCP-1减少。说明巨噬细胞向着M2表型转变。

图C，因为M1巨噬细胞产生高水平的IL-2，M2巨噬细胞产生高水平的IL-10。发现巨噬细胞与Skov3来源的外泌体共培养后IL-10的水平升高IL-2的水平降低。

图D，用MTS发检测EOC细胞活性发现，与那些与Skov-3来源外泌体共培养过的巨噬细胞的上清液共培养的EOC细胞的活性增加。小室实验发现，与那些与Skov-3来源外泌体共培养过的巨噬细胞的上清液共培养的EOC细胞的增殖能力也增加。由此说明EOC来源外泌体共培养过的巨噬细胞具有促进EOC细胞增殖和转移的能力。

图E，在活体验证刚才的理论。Skov-3细胞与Skov-3来源的外泌体刺激过或者PBS刺激过的巨噬细胞混合后腹腔内注射入小鼠。发现在Skov-3-exo组肿瘤的大小重量明显增加。

图F：发现Skov3-exo组肿瘤组织中CD阳性的细胞数增加了、微血管和淋巴管的密度也相对对照组增加了。

总的来说，这些结果说明了EOC来源的外泌体增加了巨噬细胞向M2样表型分化，以及在肿瘤微环境中这促进了血管形成和淋巴管形成，从而加速了EOC的演进。

图三，EOC细胞来源的外泌体调节SOCS3表达以及相关的信号通路。

图A:发现在与EOC细胞来源的外泌体共培养的巨噬细胞的SOCS3基因的表达下降了。

图B和C：EOC细胞来源的外泌体共培养的巨噬细胞的p—STAT3增加，SOCS3基因表达减少。

图D：Stattic是STAT3抑制剂。发现用Stattic预处理后，Skov3来源的外泌体不能使巨噬细胞发生向M2的极化。说明了，STAT3通路在巨噬细胞M2极化的过程中扮演了重要角色。

以上的这些结果说明，EOC细胞来源的外泌体可能导致巨噬细胞转化到M2表型，这个过程涉及了SOCS3/STAT3信号通路。

图四，与正常个体相比，EOC病人血清来源的外泌体中有更高水平的miR--3p。除此之外，miR--3p在EOC细胞来源的外泌体中富集，可以通过外泌体转运到巨噬细胞。

图A，6个EOC病人与6个正常人相比，EOC病人血清来源的外泌体中miR--3p的表达明显增加。

图B，说明miR--3p的表达在EOC细胞来源的外泌体中比细胞本身中高很多。

图C，数据表明加入外泌体的巨噬细胞组与对照组相比，表达更高水平的miR--3p。表明外泌体可以传递功能性的物质到巨噬细胞。

图五：在活体和试管中，miR--3p促进巨噬细胞M2表型的极化，这可以提高EOC细胞的生长和转移能力。

图A和B：与阴性对照相比，当巨噬细胞转染miR--3p类似物后，M2巨噬细胞的标记物，CD和Arg-1都诱导出现了。

图C：来自转染了miR--3p类似物的巨噬细胞的上清液与对照组相比，M2型细胞性子IL-10增加了，M1型细胞因子IL-12减少了。

图D：通过MTS和小室分析可知，来自转染了miR--3p的巨噬细胞的条件培养基与对照组相比大大提高了Skov3卵巢癌细胞的增殖和迁移能力。说明把miR--3p转染进巨噬细胞后促进了卵巢癌细胞的生长和转移能力。

图E：Skov3与转染miR--3p或miR-NC的巨噬细胞混合后注入小鼠腹腔。与对照组相比，

miR--3p组肿瘤的重量比对照组明显增大（大约大72.79%）

图F：miR--3p组癌症组织表达CD31，LYVE-1,CD的量也比对照组多。说明miR--3p组的肿瘤组织表现出产生更多微血管和淋巴管，与对照组相比。

以上这些结果都说明miR--3p上调了巨噬细胞M2表型的极化，这促进了癌症的进展。

图六：miR--3p下调了SOCS3基因的表达，以及激活了巨噬细胞中STAT3通路。图

A:TargetScansoftware预测miR--3p的靶基因可能是SOCS3。

图B：荧光素酶分析。发现miR--3p减少Luc-SOCS3-3’URT的荧光素酶活性，与对照组

相比。对照组-SOCS3-3’URT突变后miR--3p的结合位点没了。

图C和D：当巨噬细胞中转染miR--3p后，SOCS3基因的表达显著下降。

图E和F：与转染miR--3p组相比，发现用了miR--3p抑制剂后，磷酸化的STAT3减少。

图G：用STAT3抑制剂Stattic预处理后，miR--3p对巨噬细胞的极化作用就消失了。

以上这些结果说明了miR--3p可能通过SOCS3/STAT3通路在巨噬细胞向M2表型极化的过程中扮演了重要角色。

最后我们来看一下总图：

我们的研究表明：卵巢癌细胞可以通过外泌体转运miR--3p到巨噬细胞，通过靶向SOCS3以及涉及STAT3通路使，从而使巨噬细胞朝M2表型（肿瘤相关巨噬细胞样表型）分化。

从这篇文章我们可以推测：miR--3p存在于卵巢癌细胞来源的外泌体，它可能成为诊断卵巢癌的一个新的生物指标，或许也可以成为治疗这类肿瘤的一个潜在治疗靶点。

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