Nature运用CRISPRCas

汇报人：LuYinlab博士生二年级夏雅雯

《Nature》运用CRISPR-Cas9筛选系统绘制免疫逃逸基因图谱，深度解读T细胞与肿瘤细胞之间的战争

研究背景在过去的十年里，以PD-1/PD-L1抑制剂为代表的免疫疗法相继涌现，使得癌症治疗领域迎来巨变。然而，免疫治疗只在一部分患者中产生持久反应。肿瘤细胞会通过突变某些基因来躲避免疫系统的识别和杀伤，而这些变异不仅能加速肿瘤细胞的扩散，还会使其对免疫疗法产生耐受。因此，从基因水平深入了解肿瘤细胞如何实现免疫逃逸，对免疫疗法的个体化应用尤为重要。近日，加拿大多伦多大学JasonMoffat团队在Nature杂志发表了题为Functionalgenomiclandscapeofcancer-intrinsicevasionofkillingbyTcells的研究论文。运用CRISPR-Cas9基因组筛选系统，成功绘制了肿瘤细胞内源性免疫逃逸基因的图谱，并发现了多条相关通路。这一研究成果不但揭示了免疫细胞与肿瘤细胞之间盘根错节的复杂关系，更为免疫疗法的发展提供了新的思路。CRISPR-Cas9基因组筛选是基于CRIPR-cas9原理设计得到的高通量筛选系统。该系统能够通过一次慢病毒感染同时对多个基因进行敲除/过表达。这一系统由麻省理工学院的张锋教授率先使用，相关研究成果先后于、年发表在Science/Nature杂志上。CRlSPR/Cas9gRNA文库筛选大体流程分为五步，即gRNA文库选择，gRNA文库扩增，gRNA文库慢病毒包装，目的细胞感染和富集，PCR扩增和NGS测序。通过NGS测序可以得到细胞中gRNA的富集度，从而寻找到相应的基因，这些基因很有可能参与药物作用过程，因此可作为深入研究的待选基因。以耐药性基因筛选实验为例，根据前期药物IC50实验，得到药物筛选实验的处理浓度。采用高浓度药物处理感染后的细胞，经过筛选后存活的细胞则具有一定的耐药性，将此群细胞扩增并收集下来，耐药性的来源便是CRlSPR/Cas9gRNA对相应基因的修饰。本篇文章主要基于这一文库筛选系统开展研究。Result1.肿瘤相关CTL免疫逃逸的遗传图谱细胞毒性T淋细胞又称杀伤性T淋巴细胞（CTL），是机体抗肿瘤机制的重要环节，也是肿瘤免疫过继疗法主要效应细胞之一。为深入了解肿瘤细胞躲避CTL杀伤作用的内在机制，研究人员构建了一个优化的gRNA文库，其中包含个gRNAs靶向种蛋白质编码基因，试图在小鼠肿瘤细胞系中建立一个全基因组表型筛选平台，系统性地识别与肿瘤内源性CTL免疫逃逸相关的基因。研究人员通过CRISPR技术，在乳腺癌、结直肠癌、肾癌和黑色素瘤等6种小鼠肿瘤细胞中进行筛选发现，至少有个基因影响了CTL对肿瘤细胞的杀伤效果。其中包括我们所熟知的B2m、Jak1、Jak2、Ifngr1、Ifngr2等明确的癌症内源性CTL逃逸基因。我们查阅文献发现，这些基因在对检查点免疫疗法产生耐受的患者中确实经常发生突变，由此可见，基因筛选结果真实可靠。为了验证这些基因确实与免疫调节有关，研究人员对这多个基因做了基因集富分析（GSEA）发现，涉及抗原呈递、Jak-Stat信号和干扰素途径的靶基因会介导CTL杀伤抵抗，而涉及程序性坏死、p38丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号和NF-κβ途径的靶基因则能够增强CTL敏感性。此外，作者还发现了一些之前在调节免疫细胞杀伤方面未受重视的通路，例如涉及一氧化氮的产生和线粒体代谢的基因，介导了肿瘤细胞对CTL的抵抗力；而糖基磷脂酰肌醇（GPI）锚代谢、胞内体运输、转录调控和自噬相关的基因，则介导了肿瘤细胞对CTL的敏感性。总的来说，这些基因富集的信号通路都与免疫调节具有很好的相关性。Result2.定义肿瘤固有核心CTL逃逸基因为了进一步缩小包围圈，作者将至少在3个细胞系中同时存在免疫逃逸相关作用的个基因挑选出来，定义为“肿瘤固有核心CTL逃逸基因”，并且第二次运用CRISPRgRNA文库敲除，靶向上述个核心CTL逃逸基因，确证这个基因确实都在CTL杀伤过程中发挥着举足轻重的作用。这个基因发挥免疫调节作用的机制是怎样的呢？接下来，作者使用TCGA的数据库，将上述个基因与既定的抗肿瘤T细胞反应标志物相关联后发现，这个基因与IFNγ反应和先天性抗PD-1抵抗等之间存在显著的相关性。Result3.IFNγ抵抗是肿瘤实现CTL逃逸的内在机制IFNγ信号通路的调节因子可以广泛影响肿瘤内源性的CTL逃逸，这促使研究人员进一步研究决定癌细胞对这种细胞因子敏感性的基因。为此，作者再一次运用全基因组CRISPR敲除，在给予或不给予IFNγ的情况下对肾癌的细胞增殖进行基因筛选，Deepsequence分析发现肿瘤内源性的CTL逃逸除常见的Ifngr2,Stat1,Jak1,Jak2,Socs1,Ptpn2外影响最大的是Fitm2基因，以及参与到自噬通路的基因（例如：Atg3、Atg5、Atg7、Atg10、Atg12和Atg14）。Fitm2是小鼠脂肪组织中正常脂肪储存所必需的基因，但以前从未报道与IFNγ信号有关。为了验证Fitm2调节免疫的作用，作者在几个癌细胞系中敲除了Fitm2基因，发现敲除后的肿瘤细胞无论对CTL还是IFNγ都变得更加敏感。并且加入抗IFNγ抗体能够逆转这一增敏现象。也就是说，Fitm2基因的存在，实则帮助癌细胞实现了免疫逃逸。为进一步明确Fitm2介导的CTL逃逸的遗传决定因素，作者基于野生型及Fitm2敲除的肾癌细胞，再一次利用全基因组CRISPR敲除技术，在IFNγ或活化CTL的刺激下寻找与Fitm2具有遗传相互作用的基因。通过分析发现，自噬通路相关基因与Fitm2一样，只要单独突变就让癌细胞变得对IFNγ敏感。而自噬通路相关基因与Fitm2一起发生突变，肿瘤细胞就对IFNγ介导的细胞毒性有了特别有抵抗力。也就是说Fitm2会使自噬通路产生逆向的表型。可见，免疫细胞与肿瘤之间的战争中，处处都有陷阱。自噬基因与Fitm2在IFNγ和CTL刺激下的不同串扰究竟是由什么原因引起的呢？研究人员推测，自噬对癌细胞免疫逃逸的影响可能还依赖于CTL相关的其他细胞因子。果不其然，再回顾富集分析的结果发现，这些免疫逃逸相关基因与TNF-NF-κB通路也存在着良好的相关性。也就是说，自噬相关基因的背后还有TNF。Result4.自噬与NF-κβ通路共同参与肿瘤相关CTL免疫逃逸作者运用传统药理学方法验证了以上猜想：加入自噬阻断剂后，CTL杀伤作用明显强项，证明自噬基因在TNF介导的CTL敏感性中具有重要作用。并且，对91个人类细胞系进行的药物-细胞因子筛选结果显示，autophinib和TNF在41种细胞中表现出协同杀伤作用。为了阐明TNF-NF-κB通路与自噬之间的关系，作者基于野生型及Atg12敲除的细胞，第五次利用基因组敲除技术，在TNF/活化CTL的刺激下寻找差异基因。实验结果显示NF-κβ相关基因与自噬具有良好的相关性。NF-κβ下游基因往往发挥反向作用（如Rela、Chuk），而上游调节基因通常是正向遗传作用（Tbk1、Ikbkg等）。研究结果表明这两条途径并非简单的上下游关系，而是平行发挥作用并共享上游调控基因。然而，在研究自噬相关基因之间的相互作用时，奇怪的相互作用又出现了：Atg12与Atg5和Atg16l1之间具有强烈的反向表型。就是说，上面三个基因独立突变的话，都会变得对细胞毒性T淋巴细胞和TNF敏感；但是如果Atg12与Atg5同时突变，或者Atg12与Atg16l1同时突变，就会对细胞毒性T淋巴细胞和TNF表现出强烈的抵抗。这意味着，如果肿瘤已经出现了一个自噬基因突变，那么将免疫疗法与靶向另一种自噬基因的药物相结合，反而会使该患者的疾病恶化。这是之前从未预料到的。Result5.体内筛选验证自噬对于肿瘤固有CTL逃逸的关键作用为了探究自噬基因在肿瘤免疫逃逸中的作用，作者基于对自噬具强依赖性的EMT6细胞构建体内筛选系统。通过使用gRNA文库，对个肿瘤固有核心CTL逃逸基因进行敲除，皮下接种免疫功能正常的BALB/c或免疫缺陷的NCG小鼠，在不同时间点取样肿瘤组织进行测序。测序结果验证了先前定义的个核心固有基因的正确性，包括增敏基因（Ago2、Med16、Tmem）和抑制基因（Srsf7、Brpf1，Kat6a）。除此之外还观察到靶向自噬基因的gRNAs大量缺失。也就是说，肿瘤微环境中自噬在介导肿瘤免疫逃避方面具有至关重要的作用。

总结与思考

本文逻辑严谨，多次运用CRIPR/Cas9文库系统进行基因筛选，逐步缩小包围圈，层层突破，最终鉴定出了个核心免疫逃逸基因和相关信号通路。JasonMoffat团队的这一系列研究结果不仅在基因水平为我们深入解读了肿瘤细胞与免疫系统之间的斗争，挖掘出不同自噬基因与免疫抗性之间的交互关系，更是对免疫治疗的临床应用有着跨越式的指导意义。导师：陆茵稿件编辑：大鹏，小菜圆稿件审阅：陆茵预览时标签不可点收录于话题#个上一篇下一篇

转载请注明：http://www.kqkpw.com/bzcs/12244.html